王霏，肖迎珂，宣旭娴，张晓雯，刘菲，查紫仙，代梦瞳，王西成，吴伟民，房经贵，王晨
VvmiR164s-作用模块鉴定及其在葡萄子房发育过程中响应赤霉素的表达分析
王霏1，肖迎珂1，宣旭娴1，张晓雯1，刘菲1，查紫仙1，代梦瞳1，王西成2，吴伟民2，房经贵1，王晨
1南京农业大学园艺学院，南京 210095；
2江苏省农业科学院，南京 210014
【目的】鉴定葡萄miR164s（VvmiR164a/b/c/d）及其靶基因，明确VvmiR164s及其靶基因应答外源赤霉素在葡萄单性结实过程中的调控作用。【方法】以‘魏可’葡萄（L. Wink）为试材，利用miR-RACE、PCR、RLM-RACE与PPM-RACE、qRT-PCR及生物信息学等技术，分析VvmiR164s-模块应答外源赤霉素在葡萄单性结实过程中的时空表达特征及其潜在功能。【结果】赤霉素在花前处理‘魏可’葡萄，可诱导其单性结实，导致葡萄的无核。克隆鉴定了VvmiR164a/b/c/d的精确序列，预测到其4条靶基因，结合匹配程度与前期数据，在此重点分析靶基因，并将其命名为。克隆鉴定靶基因，验证其裂解位点，并对其开展蛋白进化、染色体定位及结构分析。裂解位点位于miRNA 5′端的第9位与第11位，裂解频度为17/20与11/20，定位于葡萄的Chr14上，编码363个氨基酸，含有一个NAM结构域，且其定位于细胞核。VvNAC100蛋白与其他物种氨基酸序列保守性较高，功能相似，其中与辣椒、烟草等物种亲缘关系较近。的启动子与其靶基因的启动子均包含多种激素作用元件，表明其可能通过响应不同的激素来参与葡萄生长发育的调控。RT-qPCR结果显示，随着葡萄子房的发育，VvmiR164b的表达水平呈下降趋势，其靶基因在子房发育前期呈上升的表达趋势，具有一定的负相关，而VvmiR164a/c/d与表达模式相似，呈现一定的正相关；
GA处理后，VvmiR164a/c/d在葡萄子房单性结实过程中的表达极显著地上升，进而也显著抑制了在这一时期的表达，从而促进了VvmiR164a/c/d-表达水平的负相关；
但VvmiR164b在GA处理后表现出下降的趋势，且其与的表达水平呈现一定的正相关，表明GA处理增强了VvmiR164a/c/d对的负调控，减弱了VvmiR164b对的负调控作用。【结论】是VvmiR164 家族VvmiR164a/b/c/d的真实靶基因；
在葡萄单性结实过程中，赤霉素诱导了VvmiR164a/c/d对靶基因的负调控作用，抑制了VvmiR164b对靶基因的负调控作用，VvmiR164a/c/d是VvmiR164家族参与赤霉素诱导葡萄单性结实的主效因子。
葡萄；
赤霉素；
单性结实；
VvmiR164s；
【研究意义】葡萄（L.）是一种世界性广泛种植的多年生果树，也是我国栽培的重要经济果树之一。无核是葡萄的一种重要优良品质性状[1-2]，无核葡萄因其食用简便、风味与口感佳，备受消费者喜爱。因此，葡萄无核化是一个重要的发展趋势和育种目标[3]。赤霉素（GA）是诱导葡萄单性结实的关键激素[4]，花前GA处理诱导葡萄单性结实是生产上广泛应用的一种重要无核化技术，但其分子机制尚不甚清楚。因此，开展葡萄无核分子机制的研究对无核葡萄育种具有重要意义。microRNA（miRNA）是一种长度一般在20 bp左右的小分子RNA，其在植物生长发育、信号转导及逆境胁迫中起着重要作用[5-6]。【前人研究进展】近年来，研究发现miRNA参与GA信号转导，介导植物花的发育，从而影响育性与单性结实[7-9]。其中，miR164家族在很多植物中都被发现与鉴定[10]，据报道，miR164在植物细胞分化、生长、花的发育以及胁迫具有一定的作用[11-13]。NAC家族是存在于植物中的一个庞大的转录因子家族，并且其作为miR164的靶基因参与了植物发育中的多种生理过程，如花发育[14]、胚发育[15]、促进侧根形成[16]，果实成熟[17-18]以及衰老等过程。另有研究发现，NAC转录因子对植物生长发育的调控主要通过结合NACRS或者NACBS来实现，且NAC也会受到GA的诱导并参与代谢及信号转导从而影响果实的成熟，但具体的机制尚不清楚[19]。【本研究切入点】笔者课题组前期研究发现，葡萄miR164s（VvmiR164s）在花期能够强烈响应外源GA处理，且可能靶向NAC转录因子，结合GA在葡萄果实单性结实方面的显著调节效果，推测VvmiR164s可能应答GA参与葡萄单性结实的调控，但是相关分子调控机制有待研究。【拟解决的关键问题】鉴定‘魏可’葡萄中VvmiR164a/b/c/d的成熟体与前体基因的精确序列，验证其真实靶基因，通过生物信息学分析其进化保守性和潜在功能，综合分析其应答GA在葡萄单性结实期的时空表达特征及其应答GA的时空表达模式，为进一步认识VvmiR164s-作用模块在葡萄单性结实中的调控机制提供重要信息，也为从表观遗传学角度揭示GA调控无核果实的分子机制提供参考。
试验于2020年在江苏省农业科学院葡萄实验基地进行。
选用葡萄有核品种‘魏可’作为试材。在花前5 d随机选取生长势基本一致的花序，用50 mg·L-1GA3浸蘸30 s，其对照则采用清水处理30 s。选取生长情况较为一致的葡萄花蕾，于处理后的0、1、3、5、7和10 d分别采集后用液氮立即速冻，存于-80 ℃超低温冰箱备用。
在miRBase数据库搜索并下载葡萄miR164家族的成熟体与前体序列。在NCBI上根据前体的序列预测其基因序列，并设计用于进行PCR扩增的引物（表1）。产物经电泳后回收，送公司测序。VvmiR164s成熟体相关染色体的定位通过MapInsepet（http://mg2c.iask.in/ mg2c_v2.0/）预测，VvmiR164a/b/c/d的茎环结构则利用RNA Folding Form进行分析。
表1 VvmiR164s PCR 扩增引物序列
VvmiR164s靶基因利用在线网站PSRNA Target（https://www.zhaolab.org/psRNATarget/）预测VvmiR164s的靶基因，除maximum expectation设置为3.0外，其余运行参数均为默认值。利用在线软件ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析的相关特性；
在线软件CDD分析靶基因的蛋白保守结构；
Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ plant-multi/）进行亚细胞定位分析。MIR164s与的系统进化树在MEGA 5.0中选择邻近法进行构建，并且运用chiplot（https://www.chiplot.online/）对进化树进行优化；
作用元件motif分析与基因结构构建则分别利用在线软件MEME（https://meme-suite.org/ meme/tools/meme）与GSDS（http://gsds.gao-lab.org/）进行。
构建含有GFP报告基因的super1300双元表达载体。在super1300载体上选择I和I双酶切位点，设计带有重组臂的扩增引物。将经过I和I双酶切后的super1300载体片段与带有重组臂的片段进行重组，构建验证正确的载体后，菌液大摇活化至OD600=1.0。离心后，使用对应的缓冲液（10 mmol∙L-1MgCl+10 mmol∙L-1MES+0.15 mmol∙L-1AS）重悬并调整OD600=0.2后静置4 h。选择本式烟草植株从烟草叶片背面注射，确保叶片被浸透。注射后的烟草植株置于25℃黑暗条件下3 d，以上海翊圣生物公司的DAPI染液为核染料，通过激光共聚焦显微镜进行GFP信号与DAPI信号的观察。
利用笔者实验室前期改良的RLM-RACE和开发的PPM-RACE技术[9]，鉴定VvmiR164s的靶基因，验证其剪切靶基因位点，并通过瞬时转化组织学染色对其进一步验证。
1.5.1 表达载体的构建及农杆菌介导的烟草瞬时转化 在去除报告基因（GUS）的二元载体pBI121上连接VvmiR164a/c/d，将靶基因和不含裂解位点的靶片段与GUS报告基因融合，使用的引物见表1。在含有利福平（50 μg∙mL-1）和卡那霉素（50 μg∙mL-1）的LB固体培养基中培养根癌农杆菌GV3101的单菌落（包含重组质粒）。离心收集菌体后，将细菌沉淀并重悬于悬浮缓冲液（10 mmol∙L-1MES，10 mmol∙L-1MgCl2，pH 5.6），并调整OD600=0.2后静置4 h，加入100 μmol∙L-1AS后进行浸润，室温静置4 h。利用注射器针头将细菌悬浮液注入6周龄烟草植物的叶片中，然后将渗透的幼苗移回25 ℃温室，并在黑暗中保持3 d。
1.5.2 GUS组织化学染色 在烟草叶片上打孔，取小圆片进行染色。X-Gluc（上海翊圣生物公司）的工作浓度为 2 mmol∙L-1，使用适量的DMA将X-Gluc溶解后，加入GUS组织染色缓冲液（pH7.2的PBS 50 mmol∙L-1+Triton X-100 0.1%+铁氰化钾2 mmol∙L-1+亚铁氰化钾2 mmol∙L-1+EDTA 10 mmol∙L-1）（建议现配现用）。将叶圆片浸于配置好的染色液中，37 ℃培养箱中避光放置过夜后将叶圆片取出，洗净表面染液后，放在75%乙醇溶液中脱色，水浴加热可直至叶片脱色完全，将脱色完全的叶片贴标签拍照。
利用葡萄基因组CRIBI数据库与NCBI数据库，确定VvmiR164a/b/c/d及的启动子序列，并用在线软件PlantCARE进行分析。
采用CTAB法提取不同时期的葡萄花组织的RNA，并将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，内参基因为，设置3次生物学重复，对VvmiR164a/b/c/d及进行qRT-PCR检测，数据整理采用Excel，SPSS进行差异显著性分析，GraphPad Prism软件绘制图表。
为了阐明GA对‘魏可’葡萄单性结实的影响，比较GA处理（GA）与未处理对照（CK）葡萄的花序、果实及其纵切和种子的形态（图1-A、B）。结果表明，相比于对照，GA处理的葡萄花序更长和更松散，且具有深黄色花药和大子房，同时呈现早花特性；
从图1-A与图1-B可以看出，CK中胚珠可以发育为成熟种子，而GA组中胚珠逐渐退化、消失，导致单性结实，并且在种子区域有一条明显的细线。此外，GA处理明显减小横径，增加果粒纵径（图1-C、D）。与CK植株相比，GA处理明显抑制了种子发育，改变果实形状，导致果实单性结实，形成无核果实。
2.2.1 VvmiR164s序列鉴定与分析 以‘魏可’葡萄总DNA为模板，对VvmiR164s的前体基因进行扩增，经凝胶电泳后获得4条长度不同的特异性条带（图2-A）。通过测序与序列比对发现，克隆鉴定的 VvmiR164a/b/c/d前体基因分别为561、498、543和435 bp。VvmiR164家族的成熟体序列比较分析显示（图2-B），其序列长度均为21 bp，其中，VvmiR164a/c/d成熟体序列相同，它们与VvmiR164b成熟体存在两个碱基不同（G-A与A-U）。VvmiR164 家族成员分别位于葡萄的Chr7、Chr9、Chr8和Chr14等4条染色体上，且它们的前体均可折叠成稳定的茎环结构，表明VvmiR164s能够在葡萄中稳定存在（图2-C）。
图1 GA处理对‘魏可’葡萄单性结实的影响
2.2.2 VvmiR164s的成熟体进化分析 利用MEGA5.0软件对16种植物的miR164家族进行进化关系分析与成熟体序列比对（图3-A）。结果表明，不同物种中的miR164家族成员数量不同，如烟草、番茄与拟南芥中miR164家族成员仅有2个，但也有物种含有11个miR164家族成员，如大豆；
除gma-miR164b/c/成熟体序列含有20个碱基外，其余物种miR164家族成员成熟体序列为21个碱基。通过进化树与和成熟体序列比对后发现，VvmiR164a/d与番木瓜cpa-miR164d/e亲缘关系最近，成熟体序列相同；
VvmiR164b与甜瓜cme-miR164b亲缘关系最近且成熟体序列相同；
而VvmiR164c与水稻osa-miR164e和高粱sbi-miR164亲缘关系近。虽然不同物种的miR164家族成员序列差异较小，但还是有个别物种间存在一定的差异。
2.3.1 靶基因预测及匹配程度分析 利用在线软件psRNATarget预测VvmiR164s的靶基因（表2）。结果发现，VvmiR164家族不同成员有相同的靶基因、。对VvmiR164a/b/c/d与其靶基因的匹配程度进一步分析（图4）发现，VvmiR164a/c/d、VvmiR164b与预测靶基因的匹配程度存在一定的差异，其中，VvmiR164a/c/d与的匹配程度最高，错配率为0.5；
与、的匹配程度相同，错配率为1.5，而的错配率最高，为1.8；
相比之下，VvmiR164b与的匹配程度最高，错配率为1.0，与的错配率为1.8，与、的匹配程度相同，且其匹配程度低，错配率为2.5，表明VvmiR164家族成员与靶基因间的作用强度存在差异。通过对匹配程度与前期数据综合分析，本文重点研究靶基因，将其命名为，并分析VvmiR164s-作用模块鉴定及其应答赤赤霉素调控葡萄单性结实的表达水平。
A：VvmiR164s的前体基因扩增；
B：VvmiR164家族的成熟体序列比较；
C：VvmiR164a/b/c/d染色体定位及茎环结构
表2 葡萄VvmiR164s及靶基因相关信息
ath：拟南芥Arabidopsis thaliana；
cme：甜瓜Cucumis melo；
cpa：番木瓜Carica papaya；
csi：柑橘Citrus sinensis；
fve：草莓Fragaria vesca；
gma：大豆Glycine max；
mdm：苹果Malus domestica；
nta：烟草Nicotiana tabacum；
osa：水稻Oryzasativa；
ppe：桃Prunus persica；
ptc：毛果杨 Populus trichocarpa；
sbi：高粱Sorghum bicolor；
sly：番茄Solanum lycopersicum；
mes：木薯Manihot esculenta；
zma：玉米Zea mays；
vvi：葡萄Vvtis vinifera
图4 VvmiR164s与靶基因的匹配程度
2.3.2 靶基因克隆鉴定、亚细胞定位与序列分析 对CRIBI数据库中的同源序列一致，鉴定其真实序列（图5-B）；
对其染色体定位发现，其位于葡萄的Chr14染色体上（图5-A）。利用Plant-mPLoc分析预测定位于细胞核，并进一步通过农杆菌注射烟草对亚细胞定位进行验证（图5-C）。以细胞核染料DAPI（4′,6-二氨基-2-苯吲哚）作为参照，在显微镜视野下，DAPI荧光的位置与GFP荧光的位置一致，验证了定位于细胞核。在线预测分析显示，共编码363个氨基酸（图5-D），含有一个NAM结构域，蛋白分子式C1812H2791N487O567S20，理论等电点5.70；
含有20个氨基酸，其中，含量最高的为丝氨酸，占11.3%，色氨酸与半胱氨酸含量最低，仅占2.9%。VvNAC100是一种不稳定性蛋白，其不稳定指数为44.45；
此外，VvNAC100还是亲水性蛋白，其总平均输水指数为-0.697。
A：VvNAC100的染色体定位；
B：VvNAC100克隆；
C：VvNAC100的亚细胞定位；
D：VvNAC100结构域分析
2.3.3 蛋白进化、motif元件及保守结构域分析 通过NCBI数据库对VvNAC100蛋白序列进行BLAST，获得了不同植物的相关序列。对不同物种进行同源比较，并利用MEGA5.0软件构建系统进化树（图6-A）。结果发现，烟草、辣椒与VvNAC100蛋白亲缘关系较近，而杨树、番木瓜、甜樱桃、梅花、苹果等与其关系较远。通过对不同物种的基因结构与motif作用元件分析发现，它们之间都存在着一定的差异性（图6-A、B）。在基因结构方面，的内含子数量主要是2，外显子数量是3，并且葡萄与梅花、苹果、白梨、荷花、榴莲与辣椒每个外显子与内含子的长度和分布都相似；
而在蛋白motif元件方面，VvNAC100和与大多数物种的NAC蛋白motif元件的数量和排列顺序相同，表明VvNAC100蛋白与其他物种氨基酸序列保守性较高，功能相似。在线软件CDD对结构域分析表明，VvNAC100蛋白有1个NAM结构域（14—141位氨基酸），不同物种的NAC蛋白均有一个NAM结构域，且它们大部分位于同一个位置，只有CsNAC、CpNAC与PtNAC位于不同的位置（图6-C）。
图6 NAC蛋白进化分析（A）、保守基序分析（B）与作用元件分析（C）
利用5′-RLM-RACE和3′-PPM-RACE技术验证VvmiR164s的靶基因。结果表明（图7-A），VvmiR164a/c/d均可裂解，裂解位点位于miRNA5′端的第9位与第11位，裂解频度为17/20与11/20；
而PPM-RACE的裂解位点与RLM-RACE相同，只是裂解频度存在差异，其裂解频度为5/22与1/22，低于RLM-RACE的结果。证实了VvmiR164s均可裂解靶基因，后者是前者的真实靶基因。
基于上述VvmiR164家族成员与靶基因表达的匹配分析结果，推测VvmiR164a/c/d可能是VvmiR164的主效成员，因此进一步利用烟草瞬时表达共转化体系对VvmiR164a/c/d-模块的裂解作用开展活体验证。将VvmiR164a/c/d连接到去除（GUS）报告基因的载体pBI121上，而靶基因和靶片段不含裂解位点p与GUS报告基因融合，载体构建图谱如图7-B所示，同时以pBI121- GUS作为阳性对照，而缺乏GUS的pBI121作为阴性对照（图7-C），再把构建的载体VvmiR164a/c/d分别与和p混合瞬时转化烟草叶片，通过组织化学染色证明靶裂解对转化烟草叶片中GUS活性水平的影响（图7-C）。结果显示，烟草叶片中pBI121-GUS、pBI121-VvNAC100-GUS、pBI121-VvNAC100p-GUS均显著变蓝，而在pBI121- VvmiR164a-GUS、pBI121-VvmiR164c-GUS、pBI121- VvmiR164d-GUS转化的叶片中未观察到颜色的变化。此外，pBI121-VvNAC100-GUS与pBI121- VvmiR164a/ c/d-GUS共转的叶片中蓝色程度与pBI121-VvNAC100- GUS相比明显减弱，而pBI121-VvNAC100p-GUS和pBI121-VvmiR164a/c/d-GUS共转的叶片中蓝色也有所减弱，但减弱程度不及pBI121-VvNAC100- GUS和pBI121-VvmiR164a/c/d-GUS共转化的叶片。VvmiR164a/c/d与混合转化烟草的GUS活性明显下降，证实了VvmiR164a/c/d对的裂解作用。
2.5.1 VvMIR164s及的启动子作用元件 利用在线软件Plant CARE对及的启动子作用元件分析发现（图8-A），主要包括光响应作用元件、激素响应作用元件、胁迫响应作用元件与组织特异性元件等。在靶基因的启动子作用元件中，光响应作用元件数量最多，类别最多；
而胁迫相关作用元件是厌氧诱导ARE作用元件；
在激素相关响应元件中，其仅含有赤霉素响应元件（P-box），由此推测可能响应赤霉素信号（图8-B）。而对启动子作用元件分析发现，启动子作用元件的数量和类型不同，在元件总体数量上，最多，而次之，与最少。在作用元件类型上，只有、含有组织特异性应答元件，而含有3种作用元件。所有启动子中都含有激素响应的作用元件，其应答的激素类型主要有赤霉素（GA）、生长素（IAA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）及茉莉酸甲酯（MeJA）（图8-B），但是不同类型激素作用元件的组成和数量存在较大的差异。及不同类型的作用元件类型多样性表明，它们不仅应答光、胁迫等外界环境的信号，还可能通过响应不同的激素信号参与调控葡萄的生长发育。
A：VvmiR164s对靶基因VvNAC100的裂解位点示意图；
B：载体构建示意图；
C：烟草共转化叶片GUS染色
图8 VvmiR164s及VvNAC100的启动子顺式作用元件
2.5.2 VvmiR164s-在葡萄子房发育过程中的模式分析 对VvmiR164家族不同成员的表达模式分析发现（图9），VvmiR164b在葡萄子房发育过程中基本不表达，VvmiR164a/c/d的表达量在子房发育过程中呈现倒“V”趋势；
同样地，靶基因在子房发育过程中也呈现出相似的变化趋势。
对比VvmiR164s和的表达模式（图9），发现VvmiR164a/c/d与之间呈现一定的正相关，其中，VvmiR164d的相关系数最高。此外，还发现在子房发育过程中，的表达量显著高于VvmiR164s，并且VvmiR164a/c/d与均在花前2 d有高表达，表明它们可能参与坐果过程的调控。
图9 VvmiR164s和VvNAC100在葡萄子房发育过程中的模式
2.5.3 VvmiR164s-在葡萄单性结实过程中应答GA的表达模式分析 赤霉素处理可诱导葡萄的单性结实，为了解葡萄miR164家族及其靶基因在葡萄单性结实发育过程中应答赤霉素的模式，分析它们在赤霉素处理后的表达水平。结果表明（图10-A），赤霉素处理促进了VvmiR164家族的表达，与对照相比，其表达水平在花期上升，尤其VvmiR164a/ c/d的差异表达更为明显，而赤霉素处理对VvmiR164b表达的影响不大。此外，赤霉素处理显著抑制了靶基因的表达。
通过对比GA处理后VvmiR164家族及其靶基因的表达变化相关性发现（图10-B），VvmiR164家族的表达在一定水平上与其靶基因的表达呈负相关趋势，但它们的相关系数存在差异，其中，VvmiR164c与的负相关性最强。进一步对比赤霉素处理与对照样品中VvmiR164s和靶基因表达水平的相关性，发现赤霉素的处理改变了VvmiR164s对靶基因的调控方式，其诱导了VvmiR164a/c/d对的负调控，抑制了VvmiR164b对的负调控（图9、10），表明赤霉素处理增强了VvmiR164a/c/d对的负调控作用，VvmiR164a/c/d可能是VvmiR164家族中应答赤霉素介导葡萄子房单性结实的主要调控因子。
据报道，外源赤霉素对葡萄的作用十分典型，它能够影响葡萄的生长发育[20]，改变果穗的穗形[21]，诱导葡萄的无核化[22]与改善果实品质[23]，但到目前为止，GA参与调控葡萄无核化的分子机制还不清晰。近些年，miRNA被鉴定为基因表达调控的关键因子[8,24]，其主要通过调节一系列与生长发育相关的基因来参与植物激素的信号转导、器官的形成、胁迫环境下的应答能力，对植物的生长发育具有重要作用[25-26]。另有研究表明，miRNA还可能参与调控开花时间与器官的发育形成，影响花器官的形成。笔者前期研究发现，外源赤霉素诱导miRNA参与葡萄花果发育过程中的调控，如miR156[27]、miR159[28]、miR172[29]与miR397[30]。本研究发现外源GA可介导VvmiR164s-模块参与葡萄单性结实过程的调控。
图10 VvmiR164s和VvNAC100在葡萄花发育过程中应答赤霉素的模式
前人首先在拟南芥中鉴定了miR164家族，之后通过高通量测序、同源比对、克隆测序等方法，陆续在不同植物中发现了众多序列相似或相同的miR164s，它们共同构成了miR164家族。本研究在葡萄中鉴定了VvmiR164的4个成员，其和多数物种的成员数量相同，但也与一些物种存在差异，如高粱miR164有5个成员，水稻、毛果杨等有6个成员，番茄有2个成员等，表明miR164家族成员在不同物种中存在差异。研究认为，miR164可以通过其靶基因NAC起作用。目前植物中发现的NAC转录因子的数目有8 133种，存在多个物种中[31]，其有多种生物学功能，如调控植物生长发育、参与胁迫应答、调控植物体内激素等。其中，作为NAC家族的成员，在植物的生长发育中也起着重要作用；
而在本研究中首次发现它被VvmiR164a/c/d介导，参与葡萄单性结实的调控，影响无核果实的形成。
同一个miRNA家族不同的成员具有不同的时空表达模式及不同的调控作用[32]。研究表明，在玉米中，miR164a-途径参与调节花生种子生长与膨大；
番茄中SlmiR164通过靶向负调控果实发育和成熟的时间[33]；
拟南芥中miR164通过靶向参与介导生长素信号转导途径从而调控正常发育[34]；
而水稻中miR164通过靶向调控其干旱胁迫[13]。本研究也在葡萄中鉴定了VvmiR164a/b/c/d均可通过裂解靶基因参与调控葡萄子房的发育。同时，本研究也发现，在对照样品中VvmiR164a/c/d与靶基因表达呈现一定的正相关，而在赤霉素诱导葡萄子房单性结实过程中，它们的表达水平呈现显著负相关，结合前面靶裂解作用验证结果，推测赤霉素通过诱导VvmiR164a/c/d对靶基因的裂解作用参与葡萄单性结实的调控；
另一方面，赤霉素减弱了VvmiR164b对的负调控，表明VvmiR164家族可能主要通过VvmiR164a/c/d介导靶基因的裂解在赤霉素诱导葡萄单性结实过程中发挥作用，VvmiR164a/c/d可能是主要应答GA介导单性结实的主要响应调控因子。
本研究鉴定了VvmiR164a/b/c/d 4个成员前体基因的精确序列，预测并验证了靶基因，并通过RLM-RACE与PPM-RACE技术验证了它们均可通过裂解靶基因参与调控葡萄单性结实的过程。在葡萄单性结实过程中，赤霉素诱导了VvmiR164a/c/d对靶基因的负调控作用，抑制了VvmiR164b对靶基因的负调控作用，VvmiR164a/c/d是VvmiR164家族参与赤霉素诱导葡萄单性结实调控的主效因子。
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Identification of the VvmiR164s-Action Module and Analysis of Their Expressions Responsive to Exogenous GA During Grape Ovary Development
1School of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014
【Objective】The aim of this study was to identify grapevine miR164s (VvmiR164a/b/c/d) and their target genes, and to elucidate the regulatory roles of VvmiR164s and their target genes during exogenous GA-induced grape parthenocarpic process.【Method】Using ‘Wink’ grapes (L. Wink) as the test material, miR-RACE, PCR, RLM-RACE and PPM-RACE, qRT-PCR and bioinformatics were used to analyze the spatio-temporal expression of VvmiR164s-module in response to exogenous GA and its potential functions during grape parthenocarpic process. 【Result】Gibberellin application on ‘Wink’ grapes before flowering induced parthenocarpy, leading to seedless berries. The precise sequence ofwas cloned and identified, and four of its target genes were predicted, including,,,. Combining the degree of match with the comprehensive analysis of the previous data, this work focused on the analysis of the target gene, which was named as. Thecleavage site was located at position 9 and position 11 of the 5′ end of miRNA, with a cleavage frequency of 17/20 and 11/20, respectively, and was localized on Chr14, encoding 363 amino acids and containing a NAM. The VvNAC100 protein is highly conserved in amino acid sequence and functionally similar to other species, among which it is more closely related to species such as pepper and tobacco. The promoters ofand its target geneboth contain multiple hormone-acting elements, suggesting that it might be involved in the regulation of grape growth and development by responding to mult-hormones. The RT-qPCR results showed that the expression level of VvmiR164b tended to decrease as the grape ovary developed, while its target geneshowed an increasing expression trend in the early stage of ovary development with a certain negative correlation. On the other hand, VvmiR164a/c/d showed a similar expression pattern withwith a certain positive correlation. However, after GA treatment, the expression of VvmiR164a/c/d was highly significantly increased during parthenocarpy in the grape ovary, which also significantly suppressed the expression ofduring this period, promoting a negative correlation between VvmiR164a/c/d-their expression levels. VvmiR164b showed a decreasing trend after GA treatment, and it’s the expression levels showed some positive correlation with those of, indicating that GA treatment promoted the negative regulation of VvmiR164a/c/d on, but repressed the negative regulation of VvmiR164b on.【Conclusion】was the true target gene of VvmiR164 family. During grape parthenocarpy, GA induced the negative regulation of VvmiR164a/c/d on the target geneand suppressed that of VvmiR164b on the target gene. VvmiR164a/c/d were the main effectors of the VvmiR164 family involved in modulation of GA-induced grape parthenocarpy.
grape; gibberellin; parthenocarpy; VvmiR164;
10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.012
2022-07-04；
2022-12-27
国家重点研发计划（2018YFD1000106）、国家自然科学基金面上项目（31972373）、江苏省种业振兴“揭榜挂帅”项目（JBGS（2021）086）、江苏省高等学校优势学科项目（PAPD）
王霏，E-mail：2020104031@stu.njau.edu.cn。通信作者王晨，E-mail：wangchen@njau.edu.cn
（责任编辑 赵伶俐）
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