病毒性亚单位疫苗的研究进展

苏津贤 综述，柏家林，张海霞 审校

1.西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；
2.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030

目前，多种病毒性疾病仍在全球流行，如病毒性肝炎（包括乙型肝炎、戊型肝炎等）、出血热烈性传染病埃博拉、流行性乙型脑炎等，且各类病毒及其变异株的危害日益突出。针对病毒性疾病常用的防控策略仍是接种疫苗，市售病毒性疫苗多为灭活疫苗或减毒活疫苗，可能存在毒力清除不彻底和毒力恢复等缺陷［1］。病毒性基因工程亚单位疫苗作为一种新型疫苗，发展潜力巨大。该疫苗是将病原本身的关键蛋白转化入合适的载体，表达相应的保护性抗原，再将抗原与免疫佐剂混合制备而成。由于该疫苗安全性好，且能规模化生产，为病毒性疾病的防控提供了新的思路［2］。本文从几种常见的人和动物DNA 及RNA 病毒出发，对不同病毒亚单位疫苗的研究现状及应用前景作一综述，旨在为病毒性疾病亚单位疫苗的研发提供理论依据。

1.1 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV） HBV 属嗜肝DNA 病毒科，为乙型肝炎病原体。据不完全统计，全球约有2.6 亿人感染HBV，其中890 000 死于肝硬化或肝癌等并发症［3］。早期研究发现，PreS1、PreS2、S 和HBcAg 是HBV 衣壳蛋白中具有免疫效应的片段，随机组合可制成亚单位疫苗，目前已在全球广泛研发应用，其安全性及有效性得到了世界范围的认可［4］。MALANCHÈRE_BRÈS等［5］将CpG的寡脱氧核苷酸与HBsAg（含PreS2 和S 抗原）结合免疫转基因鼠，结果显示，HBsAg 被清除的同时，还伴有特异性抗体出现，且HBV 基因在小鼠体内明显下调。为寻找更经济有效的疫苗研制方法，HAYDEN 等［6-7］利用农杆菌介导法构建含HBsAg 的玉米种子，经胚芽部位表达抗原，超临界CO2（supercritical fluid extraction，SFE）处理获得HBV 病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）。动物实验显示，小鼠血清中出现与商业疫苗相当的IgG和IgA反应。此外，所有服用VLPs的小鼠在粪便与唾液中均显示出高分泌性IgA滴度，而经商业疫苗处理的小鼠均未检测到。证明了SFE处理获得的HBV VLPs 口服疫苗在血清和黏膜表面诱导免疫反应的可行性，推动了口服亚单位疫苗的发展。尽管针对HBV 的预防性疫苗已广泛应用，但诱导有效抗体反应的治疗性疫苗仍无实质性进展。HBV 的关键结构域PreS1 是病毒黏附在肝细胞的主要位点，可作为治疗性靶点。基于此，WANG 等［8］设计了一种铁蛋白纳米颗粒疫苗，该疫苗可将PreS1运送至特定的髓样细胞，刺激滤泡辅助性T细胞和B细胞产生应激反应，诱导高效且持久的抗PreS1 反应，且免疫慢性HBV 感染小鼠可有效降低其体内病毒载量，并能清除血清中的抗原；
为慢性乙型肝炎的功能性治疗提供了一种新的研究策略。

1.2 人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV） HPV为小双链DNA 病毒，其被认为与宫颈癌、阴茎癌、头颈部癌等的诱发密切相关［9］。目前，通过杆状病毒表达系统和酵母系统分别表达研制的HPV16／18二价苗Cervarix®与HPV6／11／16／18四价苗Gardasil®、HPV6／11／16／18／31／33／45／52／58 九价苗Gardasil 9®已获批上市［10-11］。国内目前除了已上市的二价、四价、九价苗之外，还有多种类型的疫苗已进入临床阶段，见表1。

表1 国内临床阶段的HPV疫苗Tab.1 HPV vaccines at clinical stages in China

尽管已有多种HPV 疫苗成功研发，但目前疫苗的覆盖面较窄，而人群对接种疫苗的意愿不断加强，为满足预防需求，科研人员针对HPV 疫苗的研发还在不断深入。仝光杰等［12］采用毕赤酵母表达系统，成功获得与天然病毒颗粒大小相近的HPV52 L1 VLPs，用该VLPs接种小鼠后，中和抗体滴度可达106，免疫原性良好。WEI等［13］将HPV L1的N-末端截短，促进了HPV33、52、58 在大肠埃希菌中的可溶性表达，经纯化获得的五聚体在体外自组装成T=7 的二十面体VLPs，与前期经大肠埃希菌生产的HPV6、11、16、18 和31 5 种基因型的L1 巨噬细胞株联合配制了一种九价HPV 候选疫苗［14-15］，小鼠和非人灵长类动物免疫原性试验表明，该HPV 九价疫苗诱导产生的中和抗体滴度与商业化疫苗水平相当，有望成为一种新型、高效的二代HPV 预防性疫苗。除此之外，治疗性疫苗也有了新进展。SONG等［16］将两种五肽与4-氨基脯氨酸残基及其衍生物联合，与HPV E7蛋白的抗原表位共组装产生两种纳米颗粒肽疫苗，免疫TC-1 荷瘤小鼠后，可诱导树突状细胞成熟并在淋巴结内积聚、T 细胞浸润至肿瘤组织内，导致肿瘤细胞最终溶解。表明利用纳米纤维肽疫苗可进行免疫治疗，为治疗性疫苗的研究提供了新的思路。

1.3 非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）ASFV 为核质巨线性双链DNA 病毒，通过感染宿主单核巨噬细胞系统，常引起猪出血性疾病，急性期病死率高达100%［17］。ASFV基因编码多达170种蛋白，且大多数基因无明显的功能特征，使得筛选能够起到诱导保护的候选抗原非常困难［18］。目前尚未开发出有效的ASFV 预防疫苗。ASFV 关键蛋白如P30、P54及P72可诱导产生中和抗体，病毒攻击后可阻碍病毒在宿主细胞内复制及内化等过程，因此是目前研究ASFV 亚单位疫苗的重要靶点［19］。有报道称，ASFV P54 和P30 蛋白联合使用，可引发针对ASFV E75 强毒株的完全保护性免疫反应［20］；
另有研究发现，经杆状病毒表达的P54 + P30 + P72 蛋白组合对ASFV毒株Malawi的致死攻击不能提供有效保护［21］。上述结果可能是毒株来源不同所致，同时也说明仅依靠上述几个ASFV免疫原性靶点，很难获得理想的免疫保护效果。为解决免疫原性差这一难题，研究人员尝试将猪的免疫球蛋白IgA1 Fc片段与ASFV 的p30／p54基因连接，经酿酒酵母表达融合蛋白P30-Fcγ 和P54-Fcα，口服后能刺激猪产生特异性抗体和黏膜免疫反应［22］，为研发ASFV 疫苗提供了新的思路。

1.4 猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV） PPV 为单股线状DNA 病毒，无囊膜，直径约25 nm，是引起猪胚胎和胎儿感染及死亡的重要病原之一；
目前国内普遍使用全病毒灭活疫苗进行该病的防控［23］。PPV VP2 整合了主要的抗原结构域，并能诱导机体产生很强的中和抗体，因此，VP2 通常被认为是制备亚单位疫苗的关键保护性抗原［24］。中国勃林格殷格翰动物保健有限公司针对PPV1 型研制的单价亚单位疫苗ReproCyc®ParvoFLEX 在欧洲已获得许可使用［25］。YANG 等［26］选用马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus）作为表达平台，并根据密码子偏好对VP2进行优化合成，获得高效表达的PPV-VP2-VLPs，48 h产量即高达2.5 g／L；
用该VLPs 免疫小鼠，可激发高水平的IgG 抗体和血凝抑制抗体。WANG 等［27］通过优化密码子与表达工艺，获得高水平的PPV-VP2-VLPs，该VLPs 与ISA-201VG 佐剂乳化后接种豚鼠和猪，可诱导与PPV 商业灭活疫苗一致的血凝抑制抗体和中和抗体滴度，并显著降低了攻毒后豚鼠脾脏和肝脏的病毒载量。HUA 等［28］报道了一种在大肠埃希菌Transetta（DE3）中可溶性表达的重组VP2 蛋白，可自发装配成类似天然病毒形状并具有血凝活性的VLPs，以水包油佐剂配制该PPV VLPs，在豚鼠（参考模型）和靶物种（断奶仔猪和初产母猪）中均能诱导高水平的血凝抑制抗体和中和抗体。PPV VLPs单剂疫苗免疫初产母猪后，能对胎儿产生完全保护，使其免受PPV 感染。张雪花等［29］将PPV 结构蛋白VP2 插入猪IFNγ基因中，制备表达载体rBac-VP2-IFNγ，转染sf9 细胞后，表达产物可诱导小鼠产生强的体液和细胞免疫应答。刘国阳等［30］通过大肠埃希菌表达系统表达出可溶性的猪圆环病毒2 型Cap 蛋白和VP2 重组蛋白，该重组蛋白纯化后与佐剂混合制备成二联亚单位疫苗，能使小鼠产生强免疫效力。上述研究为PPV 亚单位疫苗的研发提供了重要的实验依据。

1.5 猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）PCV2 为单股环状负链DNA 病毒，无囊膜，属于圆环病毒科、圆环病毒属，病毒颗粒大小约17 nm［31］。由于PCV2在世界各地广泛存在，且与猪多种疾病相关，严重危害养猪业的发展。目前，中国勃林格殷格翰动物保健有限公司、荷兰英特威／先灵保雅动物保健公司生产的PCV2亚单位疫苗已广泛使用，但现有疫苗价格较高，因此有必要开发经济有效的PCV2亚单位疫苗。ZHANG等［32］通过改造载体构建了pBDd-3-Cap 和pBDd-2 Cap-GM-CSF 质粒，利用杆状病毒系统表达获得直径为17 ～25 nm 的VLPs，动物实验表明，Cap-GM-CSF 亚单位疫苗免疫的猪比Cap 亚单位疫苗和商业疫苗免疫的猪平均日增重更高。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）作为免疫佐剂，显著增强了猪的体液免疫应答，提高了对PCV2感染的免疫保护作用。因此，以GM-CSF作为佐剂的亚单位疫苗有望成为一种安全有效的疫苗候选物。JUNG等［33］通过用猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）GP3、GP5 及GP3 的B 细胞抗原表位替换Cap 蛋白的诱饵表位构建重组PCV2 Cap 杆状病毒，用由3 种重组PCV2 Cap 杆状病毒（Bac-Cap-GP3、Bac-Cap-GP5 和Bac-Cap-GP35）形成的PCV2 VLPs 免疫小鼠，小鼠同时产生了高水平的PCV2和PRRSV中和抗体。WANG等［34］通过EDC／NHS 法将PCV2 Cap 的氨基末端与聚乳酸-乙醇酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid，PLGA）］的羧基末端共价偶联，PLGA-Cap 能增强抗原提呈细胞对抗原的靶向性，并刺激细胞因子的分泌，诱导机体产生高滴度的中和抗体。近年来，在PCV2b亚型的衣壳蛋白（capsid protein，CP）中发现了一种可逃避宿主免疫反应的诱饵表位，为了避免诱骗效应，YU［35］等设计并制备了重组PCV2b CP（ΔCPAAAAA），将保护性中和B 细胞表位取代诱骗表位，通过小鼠和猪评价该ΔCP 诱导的保护性抗体应答能力，重组蛋白免疫后可使实验动物免受野毒株PCV2b攻击。上述研究为针对PCV2 和其他病毒亚单位疫苗的开发提供了另一种策略。

2.1 流感病毒（influenza virus） 流感病毒为RNA 病毒，传染性极强，可在多种宿主中引起严重的呼吸道疾病；
每年暴发的季节性流感可导致全球60 万人死亡［36］。流感病毒基因组易发生抗原漂移和转换，病毒变异速度快，致使人群易感［37］。LIU等［38］根据GISAID与GenBank数据库获得H7N9病毒基因与H5N1病毒的基质蛋白（M1），密码子优化后共转入sf9昆虫细胞表达，获得具有稳定结构的杂合H7N9 VLPs，免疫雪貂后产生高水平的血凝抑制抗体和中和抗体，在H7N9病毒攻击后，免疫组雪貂未出现发热、体质量减轻等明显临床症状，肺和上呼吸道的病毒增殖也得到遏制。瑞士诺华（Novartis）公司于2015年完成了对H7N9灭活亚单位疫苗的Ⅱ期临床试验［39］，将978 名受试者随机分为3组，分别于1、21 d接种无佐剂、AS03佐剂、MF59 佐剂的H7N9 疫苗，免疫2 剂后，无佐剂组在95%置信区间（95%CI，0% ～7%）中，其血清转换率（seroconversion rate，SCR）为2%，远低于AS03佐剂组的84%（95%CI：76% ～91%）和MF59 佐剂组的57%（95%CI：47%～68%），表明H7N9 灭活亚单位疫苗的免疫原性较弱，必须联合佐剂使用才能有效增强疫苗的免疫原性；
添加AS03 佐剂的疫苗组免疫2 次后的SCR 显著高于添加MF59 组，也表明佐剂AS03 更能发挥效用，比MF59 佐剂更有效地增强了疫苗的免疫原性。该免疫方案除了证明疫苗的安全性良好之外，也为佐剂的选择提供了依据。

2.2 口蹄疫病毒（food-and-mouth disease virus，FMDV）FMDV 属无囊膜的正链RNA 病毒，主要感染偶蹄类动物，是已知的传染性最强的兽类病毒之一，严重影响畜牧业的发展［40］。目前针对该病的预防主要采用灭活疫苗，但该疫苗可能存在病毒灭活不彻底等缺陷。随着基因工程技术的发展，针对FMDV 的多种新型疫苗研发成为热点。SCHUTTA 等［41］利用复制缺陷型人腺病毒5 型（adenovirus 5，Ad5）载体制备了无需佐剂协助的FMDV 亚单位疫苗，该疫苗免疫牛群后未产生严重临床症状，并能使牛群有效抵抗“A”型FMDV 强毒攻击。ZIRALDO 等［42］将Ad5载体系统进行优化，获得了针对O1／Campos／巴西／58菌株的FMDV 亚单位疫苗，无佐剂肌肉注射2 剂后，可保护94%小鼠免受同源毒株攻击。该系统的优化显著增强了疫苗性能，也为腺病毒载体系统的应用与发展提供了新的策略。LI等［43］将FMDV“O”型毒株VP1蛋白与ASIA1 型毒株衣壳蛋白片段嵌合组成VLPs，该嵌合VLPs 可保护豚鼠免受FMDV 攻击，且诱导的免疫小鼠特异性抗体水平明显高于灭活疫苗。上述研究表明，嵌合VLPs有望成为抗“O”型FMDV感染的候选疫苗。KOTECHA等［44］将FMDV O1K中编码VP1-VP3和2A基因的氨基酸序列替换为编码SAT2 的cDNA，通过大肠埃希菌表达获得嵌合病毒，该病毒的生长动力学与野生型SAT2 病毒相同，但具有更好的热稳定性，并能诱导更高水平的中和抗体滴度。LEE 等［45］通过多表位蛋白构建技术将FMDV 流行株的5 种不同B 细胞表位和1 个T 细胞表位嵌合成重组蛋白，并与猪痢疾短螺旋体的膜蛋白BmpB偶联，在大肠埃希菌中可溶和稳定表达，纯化后可在免疫小鼠血清中检测到FMDV 特异性抗体，该肽具有作为FMD 候选疫苗的潜力，可作为抗FMDV流行性变异的替代疫苗。

2.3 戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV） HEV是正向单链RNA 病毒，直径为32 ～34 nm。ORF2 编码的衣壳蛋白是研制HEV亚单位疫苗的候选片段［46］。据不完全统计，全球每年有近2 000 万人感染HEV［47］。目前，英国研制的rHEV 和中国研制的p179 HEV 疫苗已进入临床实验阶段；
由厦门大学和养生堂万泰公司联合研制的HEV 亚单位疫苗于2012 年10 月在中国境内获批上市，这是全球首个用于预防HEV 的疫苗［48］。尽管如此，基于HEV 衣壳蛋白作为亚单位疫苗的开发还在不断深入。GAO等［49］通过电转法将含有ORF2基因的质粒转化至乳酸杆菌NZ3900并进行表达，表达产物口服接种BALB／c小鼠后，检测其黏膜免疫及血清抗体，结果表明，表达产物可诱导肠道免疫和细胞免疫，有望成为新型口服HEV 疫苗。卢井才等［50］通过基因合成获得HEV ORF2 的126 ～621 位氨基酸，优化昆虫表达系统（sf9 昆虫细胞），获得的蛋白结合氢氧化铝佐剂免疫小鼠后，具有良好的免疫原性，可用于制备和开发预防性疫苗。利用植物载体系统表达经济有效的HEV 特异性蛋白也有新的进展，ZHOU 等［51］利用转基因植物烟草成功表达了HEV pE2蛋白，产量可达13.27 μg／g，且能刺激小鼠产生pE2 特异性抗体。因此，利用植物生物反应器研制HEV疫苗成为新的研究方向。

2.4 PRRSV PRRSV为单链RNA病毒，感染后易诱发妊娠母猪繁殖障碍及小猪、幼猪呼吸障碍和生长延迟等临床症状［52］。PRRSV 中由ORF2-5编码的GP2-GP5蛋白与M、N蛋白是现阶段疫苗研究的关键区域，由ORF5基因编码的GP5能诱发机体产生中和抗体［53］。ELIZONDO-QUIROGA 等［54］设计并表达了GP3、GP4、GP5 和M 蛋白组成的嵌合蛋白（PRRSV chim），该蛋白接种小鼠和仔猪后触发免疫保护作用，在一定程度上抑制了PRRSV 野毒株的攻击。MURTHY等［55］以HBcAg作为载体，融合PRRSV的免疫原性表位，经大肠埃希菌表达获得直径23 nm的杂合HBcAg VLPs，经Marc 145细胞检测，证明该PRRSV VLPs 可阻止敏感细胞感染病毒。MA 等［56］将密码子优化后的GP5m 与幽门螺杆菌铁蛋白（ferritin，Ft）融合，杆状病毒系统共表达获得GP5m-Ft 纳米颗粒疫苗，免疫猪后，能诱导比灭活疫苗更高的抗体滴度；
且GP5m-Ft免疫可促进Th1主导的细胞免疫反应，并增强特异性T 淋巴细胞免疫反应，攻毒后与未接种疫苗的猪相比，免疫组的临床症状显著降低。转基因植物生产药用蛋白经济有效，且在农业环境中风险低，AN 等［57］研制了含PRRSV GP4D 和GP5D 蛋白的转基因拟南芥植物，喂食猪后进行攻毒实验，免疫猪产生了较高滴度的PRRSV 特异性抗体和促炎细胞因子。植物来源的PRRSV 蛋白可为生产有效的PRRSV亚单位疫苗开辟新的途径。

2.5 猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV） PEDV 为线型单股正链RNA 病毒，主要引起新生仔猪急性腹泻、脱水和呕吐等，感染后死亡率高达80%［58］。S 蛋白与M 蛋白是PEDV 重要的结构蛋白，分别携带3 个和1 个B 细胞表位，是目前研制PEDV 亚单位疫苗的重要候选抗原区［59］。焦茂兴等［60］选取PEDV 疫苗株的S、M、sM基因，通过PCR等方法获得腺病毒穿梭质粒，转染Vero 细胞表达重组蛋白，细胞上清液免疫小鼠后，能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。MAKADIYA 等［61］通过对S1 蛋白的N-端进行亚单位疫苗设计，成功获得真核表达载体pPinkα-S1，转染HEK-293T细胞分泌表达，免疫怀孕母猪可诱导产生特异性IgG 和IgA；
PEDV 攻毒后，免疫组哺乳仔猪未表现出严重疾病症状。王雅婷［62］利用基因工程技术将S1 的主要抗原COE 序列与不同佐剂融合，经毕赤酵母表达系统获得rCOE、rCOE-P1Fc、rCOE-H1Fc 3 种蛋白，辅加ISA206 佐剂免疫小鼠后，均检测出高水平的中和抗体滴度，其中rCOE-P1Fc 蛋白免疫后抗体效价最高，为研制高效力PEDV亚单位疫苗提供了参考。

3.1 埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV） EBOV 为不分段的单股负链RNA 病毒，是近年来新发的最致命传染原，死亡率一度接近90%［63］。亚单位疫苗以其良好的安全性和免疫效力成为EBOV 最有潜力的候选疫苗。KONDURU 等［64］将EBOV GP 蛋白外域第1 ～637 位氨基酸插入人IgG1 Fc 片段中制成EBOVgp-Fc，此融合蛋白可形成同源三聚体，能保护小鼠抵抗致死量EBOV 的攻击。AGNOLON 等［65］认为EBOV黏蛋白缺失的构建体经CHO 表达后，可有效执行体内发生的弗林蛋白水解步骤，从而增强受体结合，因此，其将可溶性糖蛋白DTM、黏蛋白结构域缺失的糖蛋白DTM-DMUC 以及2个带有C-末端三聚化基序的糖蛋白DTM-DMUC 变异体经CHO 细胞共表达，获得可溶性三聚体重组抗原，可对EBOV 疾病幸存者自然感染产生的抗体显示出较强的亲和力。LIU 等［66］用EBOV GP 蛋白制成亚单位疫苗，配合皂苷免疫佐剂免疫小鼠，可在小鼠感染EBOV 中起到保护作用。除此之外，VP24和VP40基因所编码的蛋白可通过诱导细胞免疫应答，增强宿主的保护性免疫反应。LEHRER 等［67］将EBOV 的GP、VP24 和VP40 蛋白转入果蝇S2 细胞共表达，细胞上清液免疫小鼠后，能够100%保护致死量EBOV的攻击。

3.2 中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-corona-virus，MERS-CoV） MERS-CoV 以RNA 作为遗传物质，致死率高达35%，目前尚无获批的MERS-CoV 预防性疫苗上市［68］。有研究发现，MERS-CoV 尖峰蛋白受体结合结构域（receptor-binding domain，RBD）可作为疫苗靶标。TAI等［69］将MERS-CoV RBD 残基与Fd三聚基序（RBD-Fd）融合构建重组三聚体，其可特异识别MERS-CoV 受体，诱导高效的IgG 抗体，有效保护hDPP4转基因小鼠免受致命MERS-CoV攻击。ZHANG等［70］也认为基于MERS-CoV 尖峰蛋白RBD 研制的疫苗具有更强的免疫效价，RBD 的重组蛋白配合MF59佐剂对小鼠进行免疫，可诱导小鼠产生强的中和抗体，并能使小鼠抵抗MERS-CoV 攻击。MA 等［71］根据S 蛋白RBD 中S377-588-Fc 片段构建的重组蛋白能在小鼠与家兔体内诱导高效价的中和抗体，可作为开发MERS 疫苗的理想候选区。上述研究均证实，MERS-CoV 的RBO 蛋白是研制MERS 亚单位疫苗的一个重要抗原表位。

3.3 2019新型冠状病毒（2019 novel corona virus，2019-nCoV） 2019-nCoV属冠状病毒亚科，为单链RNA病毒，直径约160 nm，基因组大小为27 000 ～32 000 bp［72］。2019-nCoV 主要引起新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19），据WHO报道，截至2021 年10月26日，该病感染确诊人数超过2.4亿，死亡人数高达490 万［73］。尽管已研发出2019-nCoV 灭活疫苗与腺病毒载体疫苗，但针对2019-nCoV 新型疫苗的研发仍迫在眉睫。2019-nCoV 的S 蛋白RBD 是目前开发亚单位疫苗的最佳抗原区之一［74］。2020 年10月，俄罗斯针对2019-nCoV 研制的EpiVacCorona 亚单位疫苗获得了在该国使用的监管批准［75］。中国微生物研究所与安徽智飞龙科马生物制药有限公司研制的2019-nCoV RBD 二聚体亚单位疫苗ZF2001 已于2020 年11 月进入Ⅲ期临床试验，因效果突出，于2021年3月10日成为国际上第一个获批临床使用的抗COVID-19重组亚单位疫苗［76］。美国Novavax生物技术公司构建了S 蛋白全基因，经sf9 昆虫细胞表达系统制备了2019-nCoV S 亚单位疫苗NVXCoV2373，结合皂苷基Matrix-M™佐剂可诱导非人灵长类动物产生高滴度的中和抗体；
目前，该公司研制的NVXCoV2373 疫苗已于2020 年9 月在英国启动了Ⅲ期临床试验［77］。加拿大Medigen 公司研发的植物源VLPs 2019-nCoV VLPs疫苗已进入Ⅱ／Ⅲ期临床试验。另外，还有威克斯／中国华西医院、古巴Finlay 疫苗研究所和赛诺菲（Sanofi）／葛兰素史克（GSK）制药公司等研发的2019-nCoV亚单位疫苗正在进行第一／第二阶段试验［78］。TAN等［79］通过SpyTag／Spycacher技术获得直径为36 nm的2019-nCoV RBD VLPs（RBD-Spy VLPs），该候选疫苗在小鼠和猪中具有高免疫原性，诱导了高水平的2019-nCoV中和抗体反应，可作为一种有效且廉价的抗COVID-19候选疫苗。目前，在英国、南非、巴西已出现不同变异毒株，印度甚至出现了三重变异毒株，现有疫苗面临巨大的效力挑战，防控新型毒株大流行仍十分重要，研究人员针对2019-nCoV的研究仍在不断深入。

随着许多高致病性病毒在全球范围内的流行，有效的疫苗免疫仍是预防病毒感染最安全有效的方法，亚单位疫苗的研发为抵抗病毒感染提供了有效屏障。DNA、RNA 病毒及其他新发病毒亚单位疫苗的研发均取得了一定成果，其中部分病毒性亚单位疫苗已有产品上市，但大部分亚单位疫苗的研制仍处于临床前研究，距离临床研究尚有一段距离。

由于亚单位疫苗只含部分病原体的免疫活性片段，虽可诱导记忆辅助性T 细胞和B 细胞的产生，但由于其缺乏病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），难以产生记忆杀伤性T 细胞，导致存在免疫效价较低的问题［80］。目前，将亚单位疫苗与佐剂联用，可在一定程度上解决该问题。免疫佐剂能作为特异性免疫增强剂，也可作为载体将抗原靶向感染抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APCs），触发先天免疫反应，增强抗原的免疫原性［81］。其中，铝佐剂、弗氏佐剂、中药佐剂（皂苷、中药多糖、中药复方等）、蜂胶佐剂等应用较广泛，除此之外，近年来发现一些小分子多肽类具有提升机体免疫效应的能力，具备佐剂功效［82］。因其具有安全性高，获取简单，易合成，纯度高及便于储存运输等优点逐渐引起研究者的关注，有望成为一种新型佐剂，改善亚单位疫苗免疫原性弱的现状。

目前，生产应用的重组蛋白产品约30%由大肠大肠埃希菌提供，但该菌细胞内缺乏糖基化和磷酸化作用，且原核细胞质不是形成复杂二硫键的合适场所，导致外源蛋白在细菌胞质中表达尤为困难，而缺失折叠的蛋白易聚集成不溶性包涵体，生物活性低，易被内源蛋白酶降解［83］。这使得重组亚单位疫苗候选物的生产和储存复杂化。目前通过维持中间折叠条件的稳定和促进成熟结构的形成，如表达宿主的改造、融合标签的引入、伴侣蛋白或折叠酶的共表达等方式干扰蛋白质表面的疏水区域来防止蛋白聚集，可提高表达效率［84］。酵母表达系统是应用于亚单位疫苗研发的第二大表达系统，但该系统周期较长，易受菌种、外源基因特性及发酵模式等诸多因素的影响，进而制约外源蛋白的基因转录和翻译。目前，通过强启动子优化、多拷贝和高表达量菌株筛选、敲除蛋白酶等基因、促折叠因子共表达、跨膜信号肽突变以及发酵工艺的优化等策略，可大部分解决上述难题［85］。杆状病毒表达系统所表达的蛋白在生物活性、免疫原性方面均与其天然产物相近，并能将所表达的复合蛋白进行组装，在VLPs 疫苗生产中极具应用前景，但其在靶蛋白的生产过程中成本较高，糖基化程度不足、易引发细胞凋亡，存在蛋白稳定性的问题。目前通过对杆状病毒载体的设计与优化、宿主细胞部分基因的敲除／敲入、无血清培养细胞株的驯化及简化生产工艺等一系列改造，可显著改善杆状病毒表达系统的各项性状［86］。

随着研究不断深入，各系统在逐步完善，基因工程亚单位疫苗的相关研究也在不断深入及改进，期望在未来病毒性疾病的流行防控中发挥巨大作用，保障人类与动物的健康安全。

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