百合组培鳞茎一次性成球技术体系的构建

赵乙琏 席梦利

摘要：为简化百合组培操作流程，减少鳞茎培养基配方的种类，缩短种球繁育周期，满足企业及种球生产用户百合繁育的需求，以百合品种“幸运花束”为试材，通过对百合组培生长过程中的温度、光照等培养环境及激素、蔗糖、培养基等进行优化，并结合实际生产进行了筛选。结果表明，25 ℃条件下有利于百合鳞茎的发育，温度过高（≥30 ℃）或过低（≤15 ℃）都会严重抑制鳞茎的生长；
而在光照培养过程中，全暗培养不仅有利于鳞茎的发育，而且节约能源，更能满足实际生产的需求；
在激素组合诱导鳞片成芽及促进鳞茎发育的过程中，6-BA和NAA依然是百合组培的最佳组合，但在鳞片诱导成芽及小鳞茎发育膨大的过程中，其激素组合浓度虽有差异，但通过对比研究表明6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L激素组合能够同时满足百合鳞片不定芽诱导和小鳞茎发育的需求；
在蔗糖的添加中，60 g/L的蔗糖浓度有利于百合鳞茎的生长发育，过高易造成鳞茎发育畸形，过低导致营养不足；
1/2MS、MS等2种培养基对组培鳞茎根的发育差异性较小、生根状态都良好，且都显著好于1/4MS和2MS。研究表明，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖60 g/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0，在25 ℃和全暗条件下培养45 d的百合组培技术体系，可以满足百合组培规模化实际生产的需求，为百合种球繁育提供技术支撑。

关键词：百合；
组培；
一次性成球；
规模化繁育

中图分类号：S644.104+.3  文献标志码：A  文章编号：1002-1302（2023）09-0162-04

基金项目：国家自然科学基金（编号：31670603）。

作者简介：赵乙琏（1995—），女，江苏连云港人，博士研究生，从事植物细胞工程及分子细胞遗传学研究。E-mail：719591137@qq.com。

通信作者：席梦利，博士，教授，主要从事植物细胞工程及分子细胞遗传学研究。E-mail：ximenglinjfu@126.com。

百合（Lilium brownii var. viridulum）属于百合科百合属，为多年生宿根草本植物［1］。作为世界上最重要的商品和公园花卉，在切花、庭院及公园绿化等方面得到广泛的应用［2］，有力助推了乡村产业经济的发展和美丽中国的建设。近年来，随着市场需求和种植面积的增加，百合种球的需求量越来越大，但由于百合株芽、种子和鳞片扦插等传统的繁殖方法存在易带病、感病、种球品质差等缺点［3］，严重制约了百合产业的发展。而百合组培具有保持繁殖系数高、缩短种球繁育周期、种球品质好等特性［4］，有利于百合种球的规模化、标准化生产及百合新品种的培育。

目前，关于百合组培的报道较多，大多以鳞片、叶片为外植体，通过诱导愈伤、转化成苗、鳞茎生根等步骤进行并建立了高效的组培体系［5］。但由于所需培养基配方较多，培养周期较长，实际操作过程较为繁琐，生产的百合组培鳞茎质量参差不齐，因此在繁育过程中难以标准化实施及普及。简化组培操作流程，减少鳞茎培养基配方种类，构建一次性成球的百合组培技术体系，才能满足企业及种球生产用户繁育需求。然而关于百合组培鳞茎一次性成球体系的研究却相对较少。百合组培鳞茎一次性成球技术体系，就是通过1～2种鳞茎培养基配方，在基本相同的培养环境体系下，培养高品质组培鳞茎的过程。本研究是在传统百合鳞茎组培的基础上，通过对温度、光照等培养环境以及蔗糖、植物生长调节剂、培养基等培养体系的综合优化和筛选，建立了高效的百合组培鳞茎一次性成球的技术体系，可为百合种球规模化组培扩繁提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

供试百合品种为“幸运花束”，选取无病虫害、无机械损伤的“幸运花束”种球中层鳞片为试验材料，用自来水流水冲洗30 min后，先用75%乙醇浸泡摇动30 s，再用0.5%次氯酸钠消毒10 min，用无菌水漂洗4次后备用。每个试验重复3次，每个处理5个外植体。试验于2022年1—12月在南京林业大学林学院进行。

1.2 温度及光照对百合组培鳞茎发育的影响

把消毒后的百合鳞片接种于培养基（MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.3 mg/L+60 g/L蔗糖，琼脂6 g/L，pH值5.8～6.0）上，分别在15、20、25、30 ℃ 的温度和全暗条件下培养45 d，测定其生长变化情况；
25 ℃条件下，分别在自然光、光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗条件下培养 45 d，测定其生长变化情况。

1.3 不同激素组合对鳞片不定芽诱导的影响

把消毒后的百合鳞片，切成约5 mm2的方形小块，在无菌条件下接种到培养基（MS+60 g/L蔗糖，琼脂6 g/L，pH值5.8～6.0）上。诱导培养基选择MS为基本培养基，配合2种激素组合，浓度梯度为 6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）；
NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L），正交组合。在25 ℃和全暗条件下培养 45 d，统计不定芽的诱导率以及观察其生长变化情况。

1.4 蔗糖浓度对鳞茎发育的影响

把消毒后的百合鳞片分别接种于不同浓度蔗糖（0、30、60、90、120 g/L）的培养基（MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L，琼脂6 g/L，pH值5.8～6.0）上，在25 ℃和全暗条件下培养45 d，测定其生长变化情况。

1.5 不同激素组合对百合鳞茎生长的影响

将鳞片诱导形成的小鳞茎（直径0.2～0.3 cm）通过继代培养的方式接种于含有不同生长激素组合的培养基中（MS+60 g/L蔗糖，琼脂 6 g/L，pH值5.8～6.0），其激素浓度设置梯度分别为 6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L），NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L），通过正交试验组合。在25 ℃和全暗条件下培养 45 d，观察统计百合鳞茎生长变化情况。

1.6 不同培养基对百合生根的影响

将鳞片诱导形成的小鳞茎（直径0.2～0.3 cm）分别接种于1/4MS、1/2MS、MS、2MS培养基（6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L，蔗糖60 g/L、琼脂 6 g/L，pH值5.8～6.0）上，在25 ℃和全暗条件下培养45 d，观察测定其生长变化情况。

2 结果与分析

2.1 温度对鳞茎发育的影响

由表1可以看出，在15、20、25 ℃等3种温度条件下，试管鳞茎生成数量差异较小，而在30 ℃培养条件下试管鳞茎生成数量显著减少；
不同培养温度下鳞茎质量及直径均存在差异，以25 ℃条件下形成鳞茎的质量及直径最大，鳞茎质量由大至小的顺序分别是：25 ℃>20 ℃>15 ℃>30 ℃，鳞茎直径由大至小的顺序分别是：25 ℃>30 ℃>15 ℃>20 ℃；
15、20、25 ℃等3种培养温度下鳞茎生根数较多，差异不显著，而30 ℃温度下鳞茎生根数很少。通过以上指标可以看出，25 ℃条件有利于百合鳞茎的发育，温度过高（≥30 ℃）或过低（≤15 ℃）都会严重抑制鳞茎的生长发育。

2.2 光照对鳞茎发育的影响

从表2可以看出，在自然光、光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）条件下，平均每个鳞茎分别有1.5个和2.6个鳞片叶生成，在全暗培养条件下，则只有0.5个鳞片叶生成；
全暗条件下形成鳞茎的质量、直径及每个鳞茎生根数都显著大于自然光及 3 000 lx 光照16 h—黑暗8 h条件；
而自然光由于光照环境差异较大，生成的鳞茎质量大小不一，而在光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗2种培养条件下生成的鳞茎大小比较一致；
在自然光、光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗3种培养条件下鳞茎生成的数量生成的数量无显著性差异 而在自然光、 光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗2种培养条件下质量却差异显著，全暗培养不仅质量大，而且节省能源。因此，全暗培养是鳞茎发育的最佳培养方式。

2.3 不同激素组合对鳞片不定芽诱导的影响

由表3可以看出，百合各激素配比处理间的诱导率差异显著，但对单个鳞片诱导芽数和幼苗长势的影响不明显。当6-BA浓度在0.5 mg/L和 1.0 mg/L 时，鳞片不定芽诱导率都随NAA浓度增大而相应增加，并在NAA浓度为0.5 mg/L时达到最大，达80.23%，但此时幼苗长势细弱，无法满足实际生产的需求，随着6-BA浓度的继续增大，当 6-BA 浓度为1.5 mg/L时，鳞片不定芽诱导率都随NAA浓度增大而减少；
而当6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L时，鳞片不定芽诱导率和增殖系数虽然不是最高，但鳞茎发育较好，幼苗生长健壮。

2.4 蔗糖浓度对鳞茎发育的影响

由表4可见，当蔗糖浓度达到30 g/L时形成鳞茎数量最多，平均达4.23个，高于其他蔗糖浓度处理，且每个鳞茎生根数最多，在不含蔗糖的培养条件下几乎没有鳞茎形成或形成的鳞茎很小；
蔗糖浓度在120 g/L和90 g/L时，生成鳞茎的鲜质量都较大，但每个鳞片上再生鳞茎数量都较少，且都畸形最严重，鳞茎发育不正常；
只有蔗糖浓度在30 g/L和60 g/L时形成的鳞茎发育正常，而60 g/L的蔗糖条件下形成鳞茎的直径显著大于30 g/L条件下形成的鳞茎，故60 g/L的蔗糖浓度有利于百合鳞茎的生长发育。

2.5 不同激素组合对百合鳞茎生长的影响

从表5可以看出，当6-BA的浓度为 0.5 mg/L和1.0 mg/L时，鳞茎鲜质量都分别随着NAA浓度的增加而增大，当激素组合在6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L时达到最大，为3.8 g，伴随6-BA的浓度增加到1.5 mg/L时，随着NAA浓度的增大，鳞茎分球数逐渐增多，但此时，无论NAA浓度的大与小，鳞茎鲜质量都较小。综合以上分析，6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L的激素组合效果最好。

2.6 不同培养基对百合生根的影响

由表6可以看出，百合鳞茎在这4种培养基上均能生根，但是在生根率、平均根长及根的生长状态等指标上有所差异。在百合生根培养的过程中，随着培养基成分比例的增大，生根率和平均根长都呈现先升高后下降的趋势，其中以1/2MS培养基的生根率和平均根长都最大，分别达到 76.7% 和2.07 cm；
1/2MS、MS等2种培养基根的生长状态显著好于1/4MS和2MS等2种培养基，且1/2MS、MS等2种培养基在生根率及根长方面差异性较小，生根状态良好。因此，1/2MS及MS培养基均可作为百合生根的基本培养基。

3 结论与讨论

在百合组培繁育过程中，影响百合鳞茎诱导、转化等的关键培养环境及激素种类都已有较多的研究［6-8］。本研究在前人研究的基础上，对培养基、培养环境等进行了综合研究和优化，并根据实际生产需求合理选择培养基及培养环境，优化了培养体系，简化了繁琐的培养步骤，并没有像张进忠等根据培养效果筛选最优培养基及培养环境［9-11］，而是结合生产需求及对鳞茎生长的影响程度合理簡化培养环境及培养基配方。

本研究以百合鳞片为外植体，在培养温度和光暗培养环境过程中，百合鳞茎容易组培成球，这与前人的研究结果［12-13］较为一致。而在培养基选择上，通过不同大量元素浓度的培养基筛选，发现MS培养基不仅满足百合鳞茎的发育，也满足百合生根的需求，这与Monemi等在生根培养基的选择上［14-15］不同。作为组培过程中最重要的碳源物质，蔗糖对鳞茎的膨大具有重要的意义，本研究表明适宜的蔗糖浓度为60 g/L，这与前人研究［16］一致，组培鳞茎能正常生长，没有形成畸形鳞茎，随着蔗糖浓度的提高，当蔗糖浓度为90 g/L和120 g/L时，组培鳞茎虽比60 g/L蔗糖浓度时要大，但畸形率较高，鳞茎的整体质量下降严重。激素对鳞茎的生长发育具有重要的作用，陈丽静等通过6-BA和NAA的激素组合筛选了从愈伤到鳞茎生长的全过程［17-18］，而本研究则在他们研究的基础上，通过降低激素浓度组合及优化激素配置，筛选出从鳞片诱导成芽到小鳞茎生长膨大的整个过程。本研究不仅简化了操作步骤及培养基配方，而且也减少了生根培养基的步骤，直接发育成可以炼苗的百合鳞茎，其效率更高，更适用于企业的规模化、标准化生产。

本研究通過优化百合培养条件及配方，研究过程中在筛选最优的基础上，从实际生产需求及百合鳞茎品质等方面综合考量，建立了更加简洁高效的百合组培鳞茎一次性成球技术体系，即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖60 g/L，琼脂 6 g/L，pH值5.8～6.0，在25 ℃和全暗条件下培养45 d。该技术体系不仅减少了不同培养时期培养基的配方，缩短了鳞茎成球的培养周期，而且所组培的小鳞茎也完全满足实际生产需求。

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