利用丙氨酸扫描突变探究crotalphine结构与镇痛活性的关系

李梦，刘艳丽，王真，宋云扬，蒋辉

国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京 102205

已往的研究[1-4]表明，南美洲响尾蛇恐怖亚科蛇的蛇毒（venom of crotalus durissus terrificus，VCDT）具有镇痛作用。2008年，Konno等证实这种响尾蛇毒素中发挥镇痛作用的是一条由14个氨基酸残基（＜EFSPENC QGESQPC，＜E代表焦谷氨酸，含有一对二硫键C7-C14）构成的多肽，命名为crotalphine（CRP）[5-6]。Konno等在热板实验、炎症模型等多种疼痛模型上，证实CRP注射给药和口服镇痛均具有良好的镇痛活性[5-12]，因而CRP可以作为新型镇痛药物先导物，具有非常好的开发前景。然而，迄今有关CRP的结构与其镇痛活性关系的研究报道并不多，需要进一步阐明。

丙氨酸扫描即是将蛋白的某段目标序列或多肽中重要的氨基酸残基替换成无特殊侧链、中性的丙氨酸，研究突变前后目标多肽的特定属性的变化，从而确定关键的氨基酸位点，为氨基酸定点突变提供指导。为进一步研究CRP结构与其镇痛活性之间的关系，我们采用丙氨酸扫描策略将CRP中所有非丙氨酸残基位点进行突变，共设计合成14个突变体（结构见表1）。采用化学致痛的醋酸扭体实验模型对CRP突变体进行镇痛活性评价，研究CRP结构中关键的氨基酸位点，为后续CRP的结构改造研究提供理论依据。

1.1 材料

ICR 小鼠，3～4周龄，体重 20±2 g，购于北京华阜康生物责任有限公司。

CRP的丙氨酸突变体多肽由南京金斯瑞责任有限公司合成（纯度＞98%）；
冰醋酸（北京北化精细化学品有限责任公司，分析纯）；
生理盐水（0.9%氯化钠注射液，石家庄四药有限公司）。

1.2 多肽合成

采用丙氨酸扫描策略将CRP中所有非丙氨酸残基位点进行突变，编号、相对分子质量及对应关系见表1。

表1 CRP突变体的氨基酸序列

1.3 CRP的时间-镇痛效应关系研究

健康ICR小鼠，雌雄各半，随机分为生理盐水对照组（0.9%氯化钠溶液）和CRP给药组（100 μg/kg），均灌胃给药。小鼠于实验前禁食12 h，给药后 1、2、3、4、5、6 h腹腔注射 2%醋酸（现配）。观察并记录注射醋酸后15 min内小鼠扭体次数，扭体反应抑制率（%）=［（生理盐水对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数）/生理盐水对照组平均扭体次数］×100%。数据以x±s表示，采用GraphPad Prism 6.0进行统计学分析，采用独立样本t检验确定各指标组间差异是否具有统计学意义，P＜0.05表示差异有统计学意义。

1.4 CRP的剂量-镇痛效应关系研究

根据CRP的时间-镇痛效应关系研究结果，选择给药后2 h，腹腔注射2%醋酸，设计以25、50、100、200、400、800、1600 μg/kg的剂量研究CRP的剂量-镇痛效应关系，方法参照1.3。

1.5 丙氨酸扫描的突变体活性评价

根据CRP的时间-镇痛效应关系和剂量-镇痛效应关系研究结果，CRP突变体的给药剂量选择100 μg/kg，给药后2 h腹腔注射2%醋酸，对CRP突变体进行镇痛活性评价，方法参照1.3。

2.1 CRP的时间-镇痛效应关系研究

100 μg/kg CRP抑制醋酸引起小鼠的扭体反应随时间的变化关系见图1。随着给药时间的变化，CRP抑制醋酸引起小鼠的扭体反应也相应发生改变，其中，给药后2～3 h，CRP对醋酸引起小鼠扭体反应的抑制作用达到最强，与生理盐水对照组相比，抑制率为44%（P＜0.01）。因此，对于突变体的活性评价选择给药后2 h进行。

图1 CRP的时间-镇痛效应关系

2.2 CRP的剂量-镇痛效应研究

在醋酸扭体模型中对CRP的剂量-镇痛效应进行研究，结果见图2。给药后2 h，CRP对由醋酸引起小鼠扭体反应的抑制作用呈一定的剂量效应关系，在25～1600 μg/kg剂量范围，随着给药剂量的增加，抑制作用也逐渐增强。

图2 CRP的剂量-镇痛效应关系

2.3 CRP-丙氨酸扫描突变体的活性评价

CRP-丙氨酸扫描突变体镇痛活性评价结果见图3。丙氨酸扫描并合成14个CRP突变体。在醋酸扭体实验模型中，与生理盐水对照组相比，突变体CRP-F2A、CRP-S3A、CRP-P4A、CRPE5A、CRP-N6A、CRP-C7A、CRP-Q8A、CRP-G9A、CRP-E10A、CRP-S11A、CRP-Q12A、CRP-P13A和CRP-C7S均有镇痛作用，具有显著性差异（P＜0.05）。与CRP相比，突变体CRP-Q12A的镇痛作用无显著变化，突变体CRP-Q8A镇痛活性下降约17%（P＜0.05）。与CRP相比，突变体CRP-C14A镇痛活性下降约30%（P＜0.01），突变体CRP-E5A镇痛活性明显增强约20%（P＜0.05）。其他位点的突变未能产生显著的镇痛活性变化。由此可见，CRP的第5位谷氨酸、第8位谷氨酰胺、第14位半胱氨酸是CRP的关键氨基酸位点。

图3 丙氨酸扫描策略的CRP突变体的镇痛活性评价

本研究通过醋酸扭体实验模型对CRP及丙氨酸扫描的突变体进行活性评价。结果显示，与生理盐水对照组相比，除CRP-C14A外，均有镇痛作用。其中，与CRP相比，突变体CRP-E5A镇痛活性增加约20%，推测该位点极性（或电荷）的改变对于镇痛活性是有增强作用的。与CRP相比，突变体CRP-Q8A镇痛活性下降约17%，但突变体CRP-Q12A的镇痛活性变化不大。Konno[6]和Oliveira[13]等先后对这2个位点分别进行突变，生成突变体Q8K和Q12K、Q12R，结果表明CRP的12位谷氨酰胺突变不会对CRP的镇痛活性产生影响，CRP的第8位谷氨酰胺突变对CRP的活性影响较大。本研究结果与Konno等一致，第8位谷氨酰胺是CRP发挥镇痛活性的的关键氨基酸位点，而第12位谷氨酰胺不是CRP发挥镇痛活性的关键氨基酸位点。

另外，本研究发现第7位半胱氨酸的突变对CRP的镇痛活性影响不明显，说明第7位半胱氨酸并非CRP的关键氨基酸位点，而第14位（C端）半胱氨酸突变（C14A）导致CRP的镇痛活性下降约30%，推测C端半胱氨酸是CRP与靶点结合的关键氨基酸位点。

南美洲响尾蛇毒素CRP是一类由14个氨基酸残基构成的小肽，经口服就可以发挥镇痛作用，是难得的镇痛药物先导物，具有潜在应用前景。本研究初步探讨了CRP的一级结构与其镇痛活性的关系，确定其重要的氨基酸位点，为该肽进行构性优化提供了理论依据。

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