肺炎克雷伯菌核酸分子与耐药基因KPC/CMY-2,荧光定量PCR,检测体系的建立与验证

张毕明，张 利，侯正利，谭德勇，孙 菁

（1.长沙市第四医院，长沙 410006；
2.圣湘生物科技有限公司，长沙 410006）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella），革兰染色阴性、可发酵乳糖、无动力的需氧杆状细菌，是一种机会性感染病原体可引起社区获得性感染和医院感染，可导致尿路感染、肺炎、外科伤口感染甚至败血症等［1-4］。碳青霉烯类抗生素是一类广谱的β-内酰胺类抗生素，常用于治疗各类肺炎克雷伯菌感染的疾病。但据2016 年中国CHINET 耐药数据监测网数据显示，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药已超10%［5］。产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因，目前陆续鉴定出了多种耐药基团如KPC、CMY-2、CTX-M、SHV 等，耐药率高，多耐药和泛耐药肺炎克雷伯菌株给临床诊疗用药提出了巨大的挑战。

目前，培养仍旧是分离鉴定肺炎克雷伯菌株的金标准，但临床样本培养时间长，不能满足快速诊断的要求。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱技术［6］、全基因组测序技术［7］、环介导等温扩增技术［8］等检测技术不断革新肺炎克雷伯菌株的耐药基因诊断，但受限于引物和探针设计、检测成本、报告周期长等诸多因素，大部分尚未实现临床落地开展检测［9］。实时荧光定量PCR 技术与常规细菌培养法比较，具有特异性强、重复性好、定量准确、大批量检测、自动化程度高等优点，可满足临床快速检测需求。

本研究通过设计特异性探针和引物，优化检测体系条件、反应体组分用量、灵敏性和特异性验证等，建立了肺炎克雷伯菌和耐药基因KPC/CMY-2 荧光定量PCR 检测体系，下一步将建立更多的多重基因检测体系，可为临床提供快速检测碳青霉烯类、三代头孢菌素等抗菌素耐药性耐药基因分子检测平台，并可直接检测临床疑似肺炎克雷伯菌感染患者痰液标本，为临床应用奠定理论和实验室数据基础。

1.1 材料与试剂 肺炎克雷伯菌株标准菌株（ATCC 700603）；
肺炎克雷伯菌核酸抽提使用赛默飞世尔公司的样本释放剂或核酸纯化试剂按照说明书操作；
荧光定量PCR 仪为宏石SALN-96P、ABI7500。

1.2 引物设计与合成 根据G e n e b a n k 中肺炎克雷伯菌标准菌株设计引物为T 3-F ：5’-C A G C T G C C G T T G C G A A C G-3’、 T 3-R ：5’-CGGCACAGAGTTCGCCGA-3’。预期片段大小为589bp，引物为赛默飞世尔公司合成。同时为肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类基因KPC、CMY-2 分别为：T3-F：5’- AGCCTTGACCCGCGCAAG-3’、T3-R：5’-AGCGTGACGACCATGCCG-3’；
T3-F：5’- AAATCGTT ATGCTGCGCTCTGCTG-3’、T3-R：5’- TATCGGCTTTA CCCCAGGTGAAA-3’。

1.3 肺炎克雷伯菌荧光定量PCR 方法的建立 检测体系设置目标引物和内标引物探针，其中FAM 荧光基团标记肺炎克雷伯菌探针；
人管家基因Rnase P 为内标基因，CY5 荧光基团标记。反应总体系为50μL，其中引物、探针、Taq 酶、dNTPs、MgCl2、PCR buffer 共45μL，模板DNA 5μL，使用宏石SLAN-96P 进行扩增反应，以生理盐水作为空白对照，对引物浓度（2.5、5、10、15 pmol/L）、探针用量（1.25、2.5、5、7.5 pmol）、Taq 酶（5、10、15、20U）、dNTPs（0.5、1.0、1.5、2.0μL/人份）、MgCl2浓度（0.1、0.2、0.3、0.4μL），扩增反应预变性时间（95℃ 1 min、95℃5 min）、退火延伸温度和时间（55、60、65℃；
10 、20 、30 s）、扩增循环数（41、45、50）分别进行优化。

1.4 肺炎克雷伯菌耐药基因KPC/CMY-2 实时定量PCR 检测体系的建立 肺炎克雷伯菌耐药基因KPC/CMY-2 检测反应体系为50μL，其中模板DNA10μL。以生理盐水为空白对照，对反应体系中所用引物浓度（2.5、5、7.5、10 pmol/人份）、探针用量（1.5、2.5、3.5、5 pmol/人份）、Taq 酶（6、9、12、15U/人份）、dNTPs（0.5、1.0、1.5、2μL/人份）、MgCl2浓度（0.01、0.03、0.05、0.07 mol/L）等进行筛选优化，同时对扩增反应过程中的预变性时间（94℃，5 min；
94℃，2 min），退火和延伸温度（55℃、57℃、60℃）、扩增循环数（40、45、50）等反应条件进行调节与优化。

1.5 肺炎克雷伯菌核酸耐药基因KPC/CMY-2 核酸检测体系性能优化验证 设定6 个（1E3、5E2、1E2、5E1、1E1、5E0）（copies/µL）参考品浓度梯度，各重复检测20次，采用probit 算法确定最低检测限；
并在宏石SLAN-96P 和ABI7500 以最低检测限为参考品，分别重复检测20 次，进行最低检测限验证。随后，选取阴性样本、低浓度质控品2E1、中浓度质控品1E2，每个样本重复测定20 次，统计阴性样本、1E2、2E1 的检出率，分别统计检测Ct 值的变异系数（Coefficient of variation，CV）评估本试剂盒批内和批间精密度，和日内、日间精密度的CV。

2.1 肺炎克雷伯菌实时荧光定量PCR 检测方法的建立与条件优化 综合反应时间、扩增产物特异性与产物量等因素，确定实时荧光定量PCR 反应条件为：预变性时间95℃ 1 min，95℃变性10 s，退火、延伸温度及荧光信号采集为60℃、20 s，共扩增45 个循环数，总反应时间90 min。反应体系中引物浓度10 pmol/人份、探针5pmol/人份、Taq 酶15U/人份、dNTPs1.0μL，MgCl2用量为0.2μL/人份。优化后进行小试生产检测，以生理盐水为空白对照和肺炎克雷伯菌阴性样本为阴性对照，肺炎克雷伯菌DNA 的样本呈良好的扩增曲线，且肺炎克雷伯菌和内标基因Ct 值均≤35（图1）。

图1 肺炎克雷伯菌实时荧光定量PCR方法的特异性扩增曲线

2.2 肺炎克雷伯菌耐药基因KPC/CMY-2 检测体系设计 通过对反应组分和条件摸索，确定引物浓度5 pmol/人份、探针2.5 pmol/人份、Taq 酶9U/人份、dNTPs 1.0μL/人份、MgCl20.03 mol/L 时，肺炎克雷伯菌两个耐药基因KPC 和CMY-2 呈良好的扩增曲线（图2），反应条件为：94℃ 5 min；
94℃ 15 s；
57℃ 30 s，45 个循环，在每个循环退火阶段收集荧光信号，总反应时间90 min。

图2 肺炎克雷伯菌耐药基因KPC/CMY-2荧光定量PCR扩增曲线（A：宏石SLAN-96P扩增曲线；
B：ABI7500扩增曲线）

2.3 肺炎克雷伯菌耐药基因KPC/CMY-2 检测体系性能优化验证 Probit 算法确定本检测体系最低检测下限为13.57 copies/µL，综合后定为15 copies/µL（图3A、B）。随即在宏石SALN-96P、ABI7500 扩增仪进行最低检测限验证，以1.5E1 为参考浓度，重复测定20 次后统计数据显示检出率为100%，符合检测率≥95%表示灵敏度验证通过（图3C、D、E）。

图3 肺炎克雷伯菌耐药基因KPC/CMY-2检测体系灵敏度验证（A：不同浓度梯度检测耐药基因KPC/CMY-2在宏石SLAN-96P扩增曲线；
B：Probit算法确定检测体系检测能力；
C：1.5E1参考品浓度在宏石、ABI7500扩增仪扩增曲线，n=20；
D、E：耐药基因KPC、CMY和内标基因IC分别在7500和宏石扩增仪的Ct值统计）

如图4 所示，阴性样本（negative control；
NTC）在两个不同批号试剂检测的阳性检出率均为0%；
低浓度质控品2E1 的阳性检出率均为100%。两个批号试剂盒批内精密度Ct 的CV 范围为：0.30%-1.28%；
批间精密度Ct 的CV 范围为：0.54%-1.50%。因此，可以认为本试剂盒批内、批间均有着很好的检测精密度。

图4 肺炎克雷伯菌耐药基因KPC-CMY-2检测体系批内、批间精密度验证

两批试剂盒检测体系日内精密度Ct 的CV 范围为：0.44%～2.52%；
两批试剂盒检测体系日间精密度Ct 的CV 范围为：0.77%～4.36%，均小于5%。结果进一步验证了本检测体系在不同的操作者下和不同的时间内检测均有着较好的检测灵敏度和精密度。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella），是医院内感染的主要病原体，约占革兰阴性菌感染的1/3，可导致肺炎、尿路感染、手术伤口感染甚至菌血症等，主要易感因素为免疫功能受损和侵入性操作［10］。高毒力型肺炎克雷伯菌可引起无基础疾病社区健康人群触发侵袭性感染，以化脓性肝脓肿最为常见，还可包括眼内炎、脑膜炎、骨髓炎和坏死性筋膜炎等［11，12］。碳青霉烯类抗生素历来是治疗肺炎克雷伯菌感染的首选药物，但由于近年临床对碳青霉烯类抗生素滥用导致选择压力，造成肺炎克雷伯菌多耐药、泛耐药等耐药基因的突变和播散。多种碳青霉烯酶相继发现，其中KPC 酶是最重要的碳青霉烯酶，可由质粒介导快速传播［13］，同时在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中还可普遍观察到其他重要的β-内酰胺酶如SHV、CTX-M、TEM 等，可水解早期头孢菌素和青霉素［14］。因其抗生素的选择压力及耐药基因突变率高，愈加扩大抗生素的耐药范围，使得临床早期正确用药壁垒重重。

目前，细菌培养与鉴定仍是常用的肺炎克雷伯菌的检测方法，但其操作流程繁琐且耗时耗力，不能满足临床快速诊断的诉求。肺炎克雷伯菌耐药性复杂多变，传统的体外药物敏感试验，操作时间长，敏感性、特异性受限，目前最新质谱技术也不能成熟检测细菌耐药基因［15］。分子生物学检测方法因其灵敏、快速的特质可极大地弥补培养周期长的缺陷，在最佳治疗时间指导临床抗生素用药。本研究针对肺炎克雷伯菌和耐药基因KPC-CMY-2 设计引物和探针，建立荧光定量PCR反应检测体系，能满足临床快速诊断肺炎克雷伯菌，检测时间为90 min，可呈批量检测。两套检测体系可根据扩增曲线实时、直观的观察检测全过程，无需进行PCR产物凝胶电泳就可报告临床检测结果。本研究检测体系特异性强，灵敏度高，检测下限可低至13.57 copies/µL，且检测试剂盒批内、批间和日内、日间精密度CV均小于5%。后续我们进一步收集临床菌株，对肺炎克雷伯菌和耐药基因KPC/CMY-2 进行临床菌株检测验证，表达量分析与临床诊疗、抗生素用药关联等方面进行临床落地应用实践。肺炎克雷伯菌和耐药基因KPCCMY-2 实时荧光定量PCR 检测体系的建立，可建立快速检测肺炎克雷伯菌，和耐碳青霉烯类、三代头孢菌素等抗菌素耐药性基因分子检测平台。多重PCR 检测体系可为本地区肺炎克雷伯多重耐药基因的流行病学调查、感染治疗提供实验室理论和实践数据指导。

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