气质联用仪在红茶香气检测中的应用概况

李秀怀 刘宗莉 曾贞

（华南农业大学园艺学院 广州 510642）

气质联用仪（GC-MS）结合了气相色谱（GC）高分辨率与质谱（MS）高灵敏度的优点，解决了单独使用气相色谱或质谱仪进行分析所带来的局限性，因兼具灵敏度高、选择性强、分离和鉴定可同时进行等特点，该技术近年来被广泛应用在食品、医药、环境、农业等领域。中国是世界上最早生产和饮用红茶的国家，红茶是中国六大茶类中最具影响力的茶类之一[1]，一直备受消费者的喜爱，其香气是茶叶感官审评的重要因子，不同地域、不同品种的红茶香气风格各异，表现出甜香、果香、蜜香、花香等多种香气类型。研究不同种类红茶中的挥发性香气组分及确定其主要呈香物质，对于不同红茶品种的区分、红茶加工技术的提升、以及红茶品质真伪的鉴定等具有重要的意义。分析香气的组分及含量，是茶叶研究的重点，近年来，GC-MS联用技术将红茶香气组分的研究推向了高潮，本文主要介绍了气质联用技术及其在红茶香气检测中的研究，并提出了展望。

气相色谱-质谱联用 (GC-MS) 技术是目前最成熟的两谱联用技术，通常简称为气质联用，是指将气相色谱仪器 (GC) 与质谱仪 (MS) 通过适当接口 (interface) 相结合, 借助计算机进行联用分析的技术[2]，根据气相色谱柱固定相的物理状态，可将其分为气固色谱法 (填充柱气相色谱法) 和气液色谱法 (毛细管气相色谱法)[3]。气质联用技术的原理是首先在气相色谱中，利用被测混合物各组分在色谱柱中气体流动相与固定相之间分配系数的差异，实现对待测混合物中的多组分分离；
再利用电离源将已分离的各种成分分子电离为离子后输送入质量分析仪器，根据不同离子在磁场中运动行为不同将离子按照质荷比分离，经过分析后再将所得质谱信号数据输入到计算机中[4]。经色谱柱分离后的样品源源不断地流入离子源，离子源再不断地将离子输送入质量分析器，设定好分析器扫描的质量范围和扫描时间, 即可在计算机上采集到分离好的质谱图[5]，质谱图上色谱峰的保留时间是被测物质定性的依据，依据色谱峰的峰高或峰面积又可实现对被测物质的定量分析。因兼具色谱的高分辨率和质谱的高灵敏度，且有大量标准谱库等特点，气相色谱联用技术被广泛应用在食品、医药、环境、化妆品等领域，作为挥发性物质检测与分析的重要工具，以期同时实现对混合物中组分的快速分离和对化合物结构特点的精准分析。

香气是构成红茶质量的基本属性之一，在感官审评中是评价红茶优劣的重要因素，常被用作红茶等级划分的重要指标。红茶中的芳香物质种类繁多，且化学组成及结构复杂多变。目前，已从红茶中检测出的香气成分多达400多种[6]，主要香气物质涵盖醛类、醇类、酮类、酯类、烯类、烷烃类等[7]，其中以芳樟醇及其氧化物、香叶醇、苯甲醇、苯乙醇、水杨酸甲酯等物质为特征香气物质[8]。红茶香气物质形成机理复杂，通常是在萎凋、揉捻、发酵、干燥等加工工序中，由香气前体经糖苷类水解、美拉德反应、脂肪酸氧化、类胡萝卜素降解、异构化等反应综合作用形成。

红茶的产地、品种、加工工艺，芳香物质的含量、种类、比例、强度等因子[6]，均会影响红茶在香型上的最终呈现，目前，市场上的红茶香型各异，包括玫瑰香型如滇红[9]、花果香型如祁门红茶[10]、松烟香型如正山小种红茶[11]等。杨彩霞[12]等采用同时蒸馏萃取-气相色谱质谱联用（SDE-GC-MS）法，探究不同烘焙条件下滇红香气化学成分的变化，结果表明在70℃、90℃烘焙1～4 h时，苯甲醇等主要香气成分明显增加，呈现出玫瑰香、花香、甜香；
而在90～110℃烘焙温度下，含量明显增加的是α-松油醇、吡嗪等物质，呈现出松香、烤香、焦香。由此表明红茶香型是由多种因素综合作用的结果。

传统的茶叶感官审评是茶叶香气检验的重要手段，但无法完整提供关于香气物质种类及含量的信息，且因主观因素而存在一定的局限性。为加强对红茶香气特征的科学全面认识，在传统茶叶感官审评的基础上，人们结合精密仪器——气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，对红茶的呈香成分进行更加客观的检测与鉴定。

香气物质的提取与收集是茶叶香气检测的第一步，目前常用的茶叶挥发性物质提取手段有水蒸气蒸馏法(Steam distillation, SD)、旋转锥体柱蒸馏法(Spinning cone column Distillation, SCCD)、固相微萃取法(Solid phase microextraction, SPME)、同时蒸馏萃取法(Simultaneous distillation extraction,SDE)、超临界流体萃取法 (Supercritical fluid extraction, SFE)等；
在完成提取的基础上，再结合气质联用技术，对红茶中的香味物质的种类及含量进行测定。

3.1 SD-GC-MS联用检测红茶中的香气物质

SD法常用于分离和萃取与水不相溶的挥发性物质，其工作原理是利用水蒸气将挥发性较强的组分带出，经冷凝管冷却后与水分离。谭文涵[13]等在对比研究普洱大叶种红茶和熟茶中的20种挥发组分时，便应用了SDGC-MS的分析方法。SD法虽然设备简单、操作容易、能有效节省研究成本，常用于挥发性物质的大规模提取[14]，但因提取过程香气组分易因受热等影响发生氧化、降解等化学反应，致使提取到的挥发性组分可能不全或一些馏分可能分解损失，无法确保香气物质的真实性。

3.2 SCCD-GC-MS联用检测红茶中的香气物质

SCCD是一项高效独特的液-气接触蒸馏技术，在国外已被广泛应用在茶叶、咖啡、植物精油的提取以及葡萄酒、啤酒的脱醇[15]。在旋转锥体柱内，液态物料由于重力作用向下流动，与逆流向上的蒸汽或惰性气体接触进行相互传热和传质，而旋转锥高速旋转时产生的离心力又推动物料向上移动至锥体柱顶部的冷凝系统，如此反复上下流动以实现挥发性成分的分离或收集浓缩[16]。与SD法相比，SCCD蒸馏时间短，除了更适用于提取热敏性香气化合物，在维持茶叶本身自然香气特征方面具有独特的优势之外，还能提取出微量的香气成分，更完整地呈现茶叶原有芳香成分的种类与含量。马占福[17]等分别采用SD-GC-MS法与SCCD-GC-MS法研究滇红茶中的香气物质，并将所得萃取液添加至茶饮料半成品配制成饮料成品，结果显示SD获得的滇红茶特征香气成分有23种，SCCD有42种，且后者提取到的萃取液制成的茶饮料成品在色泽、口感、香气等方面均优于前者。除红茶外，在绿茶香气研究方面也有类似的报道：高阳[18]等以西湖龙井一级绿茶为对象，用GC-MS分别从SCCD法与SD法获得的香气提取物中鉴定出82种和52种香气物质，其中，SCCD提取物中能代表茶叶香气特征的成分占比更大，而SD提取物中低挥发性脂肪酸以及由酯类或配糖体受热分解产生的物质的含量更多，即SCCD法的萃取效果优于SD法。但因涉及复杂的旋转部件与流体动力学模型的设计技术，国内对SCCD在茶叶香气提取的研究还十分少。

3.3 SPME-GC-MS联用检测红茶中的香气物质

SPME是上世纪90年代Arthur和Pawliszyn经过研究后首次提出的一项集采样、萃取、浓缩、吸附和进样为一体，同时无需溶剂的新型样品预处理技术[19]，其操作简单、检测灵敏度高、符合绿色化学的要求、能快速高效地完成对样品的前处理，在红茶香气分析上具有独特优势。尽管该技术在发展中已不断趋向成熟，但目前在实际样品分析过程中仍存在一定的缺陷，如萃取头价格昂贵、维护成本高；
萃取头涂层对样品的吸附量较少、且易残留[20]。为进一步推动SPME法在茶叶香气研究上的应用，学者们通过研究对影响萃取效率的因素包括萃取头涂层材料的选择、样品量的投放、提取温度时间等条件进行了优化，建立起针对某种特定茶样的最佳萃取条件体系。李云飞[21]等对研究了影响固相微萃取提取红茶香气的各种因素，对5种不同型号的萃取头进行了灵敏度和重复性实验,得出当萃取条件为NaCl饱和度100%、茶水比1：5.92、萃取时间60.9 min、萃取温度60℃时，提取云南红茶香气成分效果最好的结论。

固相微萃取有三种常用的萃取模式：直接固相微萃取(Direct SPME)、顶空固相微萃取(Headspace SPME)和膜保护固相微萃取(Membrane-protected SPME)，其中HS-SPME萃取模式更适用于易挥发性有机物的分析，因此更适合作为提取茶叶香气物质的手段[22]，是当前茶叶香气物质提取应用最多的方式之一，目前也有不少关于HS-SPME-GC-MS联用检测分析红茶中香气物质的研究。杨春[23]等按叶型将久安古茶树资源划分为5类后统一制成红茶茶样，采用HS-SPME对这5类茶样挥发性成分进行提取，用GC-MS共鉴定出83种挥发性物质，并分析出了5类叶型红茶香气特征不同的原因。黄浩[24]等采用HS-SPME-GC-MS技术对春、夏、秋季的黄金茶1号工夫红茶的香气品质特征进行研究，结果表明：3个季节的工夫红茶样品共有香气组分40种，标志差异性化合物有13种；
秋季红茶中挥发性成分种类与含量均为最多（共66种，总量为345.67μg/L），春季红茶中最少（共51种，总量为206.09μg/L）；
基于对这3个季节工夫红茶香气成分含量的主成分分析，其建立了可有效区分春、夏、秋季的工夫红茶样品的最小二乘-判别分析模型，为该品种工夫红茶香气的品质鉴别提供了技术支持。

3.4 SDE-GC-MS联用检测红茶中的香气物质

SDE是Likens和Nickerson于1964年提出后经多次改进的一种提取挥发性组分的手段，其工作原理是将样品和萃取溶剂的蒸汽在密闭装置中充分混合, 进行反复多次萃取[25]。SDE法重复性高，能将样品的水蒸气蒸馏和馏分的溶剂萃取两个步骤合二为一，以获得浓缩过数千倍的高浓度的挥发性有机物[26],是收集红茶香气的一种有效手段。杨停[27]等联用SDE-GC-MS结合主成分分析法，在祁门红茶茶样中共检测到48种挥发成分，主要香气物质类型为醇类、醛类、芳香烃类、酸类，分别占比54.33%、20.98%、8.54%和6.04%。陈泉宾[28]等以茗科1号红茶茶样为试验材料，采用SDE-GC-MS法探讨低温复式加工技术对红茶香气的影响，结果表明低温复式加工技术能实现增加具花果香味香气物质的含量的同时降低具有青草气的青叶醇的含量，为生产花香型红茶提供了一种新的加工技术。

SDE的特点是萃取温度高，高温作用时间长，该特点使其在萃取低挥发性挥发物上更具优势，但同时，长时间的高温作用又可能会造成香气组分在提取过程中发生不同程度的热变化, 产生一些非原有化学成分 (包括挥发性成分)，不利于反映香气物质的真实组成[29]。这一点在红茶香气分析上还未见阐述，但在其他茶类的香气分析上已经有研究表明：Du[30]等通过对SPME和SDE分别提取到的普洱茶挥发性化合物进行对比研究，发现SDE法虽然提取到的挥发性化合物比SPME提取到的少，但在提取低挥发性化合物如高分子量的醇、酯和酸方面上，SDE法效果好于SPME法。朱晓凤[31]等采用了SDE法、HS-SPME法分别对霍山黄大茶的香气成分进行了提取，发现SDE法提取到的醇类物质、顺式芳樟醇氧化物（呋喃）及杂环类化合物相对含量较高；
其分析可能的原因之一是SDE的蒸馏萃取条件比较苛刻，导致萜烯类氧化反应、糖苷类前体物质水解反应或其他反应（如美拉德反应、Strecker反应等）加剧而产生伪影。

3.5 SFE-GC-MS联用检测红茶中的香气物质

SFE是一种以超临界流体(supercritical fluid, SCF)作为流动相的分离技术。SCF指状态处于本身临界温度与临界压力以上的同时具有高溶解能力与高扩散性能的物质，其对多数物质有极强的溶解能力，是一种优良的溶解剂[32-34]。CO2不可燃、无腐蚀性、成本低廉，是SFE法使用中的首选溶剂，在农业、食品、医药、化工等领域被普遍用作萃取剂提取挥发性物质。1975年时，这项技术就已经被应用在茶叶香气物质的提取上[35]。SFE-CO2法的工作原理是利用CO2在超临界状态下具有强提取自然产物的能力，通过调节体系的压力与温度来控制其密度，从而提取出香气物质以及将被溶解的香气物质从气相中分离出来。孙海林[36]等采用GC-MS技术对超临界CO2萃取法香气提取物进行检测，考察该方法是否可用于提取滇红茶香气成分，结果表明：GC-MS成功从该茶样提取物中检测出近50种香气成分，超临界CO2流体萃取技术可用于滇红茶有效香气成分的提取。同时其通过单因素实验、正交实验确定了该技术萃取云南凤庆滇红茶样的最佳工艺。SFE法优点是无毒无污染、无有机溶剂残留，且与SDE法相比操作温度更低，得到的萃取物中所含成分几乎与原始茶样中的完全相同[37,38]，萃取率高。这一点可以借鉴铁观音香气的研究：黄长修[39]等对比了SDE与SFE分别获得的铁观音香气萃取物，结果表明：SDE所得提取物鉴定出45种成分, 总萃取率为0.122%；
SFE的萃取物鉴定出33种成分, 总萃取率为0.231%；
即虽然SDE获得的香气组分更多, 但这可能是因为SDE在高温萃取过程中产生了一些新的挥发性衍生物；
而从萃取物中主要香气成分的质量分数与萃取率来看，SFE更高。此外，与SPME相比，SFE法可处理的样品量大，但SFE对设备要求较高，投资成本大[40]，在红茶香气物质的检测上，还是不如SPME-GCMS应用广泛。

表1 常用前处理办法提取红茶香气物质的优缺点

3.6 GC-MS与其他技术联用检测红茶中的香气物质

GC-MS是定量定性分析香气物质的一种有效手段，但无法具体衡量某一香气组分在香型的形成中是否有贡献或贡献程度的大小；
而红茶香气特征的形成不仅取决于挥发性物质的种类与含量，还取决于香气组分的贡献值与相互之间的作用。因此，在检测方面，常将GC-MS与嗅闻仪、电子鼻等仪器联用，解决GC-MS在风味研究中的难题。气相色谱-嗅闻-质谱（GC-O-MS）联用技术集分离、定性定量分析、活性成分识别等优点于一体，既能鉴定物质的结构,又能有效地鉴别食品中关键的气味活性成分[41]，已成为食品香气分析领域的研究热点，在红茶香气方面也有相关的研究报道。Xiao[42]等采用GC-MS在谭阳红、滇红、祁门红、宜兴红4种中国工夫红茶中依次鉴定到63种、64种、62种、62种香气物质后，用GC-O对这些香气物质进行嗅闻分析并筛选出了香气活性化合物，以此为基础通过偏最小二乘回归（PLSR）对茶叶样品、感官属性和香气活性化合物之间的关系进行建模，开发了一种可靠、客观描述工夫红茶香气的方法。葛晓杰[43]等联用GC-O-MS技术，对形成花香型红茶、甜香型红茶两种不同香型的关键活性成分进行分析，检测出水杨酸甲酯、橙花醇、苯甲醛、氧化芳樟醇在“花香型”红茶中呈香更显著，而脱氢芳樟醇、(反,反)-2,4-庚二烯醛、(反,反)-3,5-辛二烯-2-酮在“甜香型”红茶中呈香更显著，这7种成分是决定两种香型差异的关键性因子，为研究不同香型红茶的呈香因子与理化性质提供了借鉴。

电子鼻检测技术，是通过模拟人类嗅觉系统的工作特性，对样本挥发性物质进行识别、分析、分类的一项仿生技术。在电子鼻系统内置有传感器阵列和多元数据处理器，能实现对复杂气味信息的采集与综合判定，与GC-MS联用，能实现对茶叶香气的科学全面评价以及对不同品质茶叶的有效区分[44-46]。李达敏[47]等对电子鼻与感官分别审评不同海南红碎茶的结果进行比较，发现电子鼻技术结果与感官审评基本一致，且电子鼻可以呈现不同红碎茶的香气指纹图谱以区别不同的茶叶，比单纯感官审评结果更全面。王帅[48]等分析用电子鼻区别有机正山小种红茶、普通一级正山小种红茶、普通二级正山小种红茶3个等级不一的正山小种红茶的可行性，结果表明：对于香气存在明显差异的有机正山小种红茶与普通正山小种红茶，以及香气差异较小的2个不同等级的普通正山小种红茶，电子鼻都能成功加以识别与区分；
由此说明电子鼻技术也能为同类型不同品质的红茶的鉴定和认证工作提供简捷快速的途径。Yan[49]等联用GC-MS与电子鼻技术对富蕴6号和金观音2个茶树品种红茶的主要香气成分和香气差异进行了研究，GC-MS结果表明2个品种中有9种香气物质存在显著差异，电子鼻的结果表明内置的10个传感器中有5个能够识别2个品种的香气差异并加以区分，研究结果阐明GC-MS与电子鼻的联用能为不同品种红茶香气成分的检测与区分提供技术支持。

在数据分析方面，GC-MS联用技术的应用一般与香气活度值(odor activity value, OAV)结合，以此筛选出构建香气特征的关键香气活性物质，完善香气检测与鉴定体系的同时为香气改良提供理论指导。OAV是指样品中挥发性物质浓度与该物质香气阈值的比值[50]，当OAV＞1时，将该物质定义为关键香气组分；
当0.1＜OAV＜1时，将该物质定义为修饰性香气组分；
当OAV＜0.1时，将该物质定义为潜在香气组分；
在一定范围内，OAV值越大，说明该物质对总体香气形成的贡献程度越大[51]。张韵[52]等采用HS-SPME-GC-MS对3种高香种工夫红茶进行提取检测后，从中筛选出23种OAV值大于1的关键香气组分，并以此为基础利用偏最小二乘回归法分析了茶样香气特征与关键香气成分之间的关联，为该品类红茶的品质评定与调控提供了理论支撑。郑鹏程[53]等先用HS-SPME-GC-MS法初步明确湖北省32个不同区域红茶香气物质种类与总量，后结合OAV值进一步探讨32个红茶的主要香气成分与香气类型。尹鹏[54]等采用HS-SPME-GC-MS结合香气活度值对4种信阳红茶样品的香气成分进行了分析，结果共检测到88个主要香气成分，含量高且OAV值大于1的香气成分有芳樟醇、β-紫罗酮等7种，含量较低但OAV值较高的有β-大马烯酮、癸醛等5种，其中β-大马烯酮的OAV值高达272.00，侧面表明了香气组分含量高的物质，在茶叶呈香中的贡献不一定大。OAV值的测定，为红茶香气构成的研究分析提供了更为科学的判断依据。

综上所述，水蒸气蒸馏法(SD)、旋转锥体柱蒸馏法（SCCD）、同时蒸馏萃取法(SDE)、固相微萃取法(SPME)、超临界流体萃取法(SFE)在红茶有效香气成分的提取与收集上均有较好的适用性，但每种前处理方式都有其优点与缺点，为确保真实体现红茶本身香气品质，在实验时应根据实际需求加以选择。在对香气物质进行恰当前处理的基础上，采用气质色谱质谱联用技术能实现对红茶挥发性香气物质的有效检测与评定，进一步明确香气品质形成的化学物质基础；
与嗅闻技术、电子鼻技术等结合，还能弥补传统感官审评受主观影响较大而使评审结果出现较大误差的缺陷，更客观、全面、准确地实现对红茶品质的量化分析及品种分类。目前国内外应用GC-MS联用技术对红茶类香气的分析多集中于大吉岭红茶、祁门红茶、滇红、正山小种红茶等品种，对广东地区主产红茶品种特征香气组分种类与含量的研究还有待进一步加强，以用于构建其香气特征GC-MS谱带，为其香气的控制与优化积累更多更全面的科学性研究数据，为其香气审评及品质鉴定提供更快速便捷的技术支持。

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