甘薯WRKY转录因子编码基因IbWRKY53L的生物信息学及表达特性分析

郭 芬， 孟小庆， 刘思媛， 张成彬， 李宗芸， 朱明库

(江苏师范大学 生命科学学院，江苏 徐州 221116)

植物在生长发育过程中，会遭受各种各样的生物与非生物胁迫，其生长、发育以及产量会受到严重的影响[1].为适应多变的环境，植物已进化形成一系列复杂的抗性机制，这些机制通过调节基因表达使植物可在恶劣的环境中生存下来[2].在此过程中，转录因子扮演着关键角色，它通过与靶基因启动子中的顺势作用元件相结合，调控胁迫相关基因的表达；
这些转录因子包括NAC、WRKY、MYB、BZIP、ERF等[3].另外，除了在植物应答盐、旱等非生物胁迫中发挥作用外，转录因子还参与对多种激素的调控过程[3].

WRKY蛋白因含有1个高度保守的WRKY结构域而得名，是植物中最大的转录因子家族之一.WRKY转录因子可以识别并结合目标基因启动子中的W-box (TGACC(A/T)序列[4].WRKY结构域长度约为60个氨基酸，其N末端含有1个保守的7肽核心序列WRKYGQK，C端有1个C2H2型 (CX4-5CX22-23HXH)或C2HC型 (CX7CX23HXC)锌指基序[5-6].同时，在WRKY转录因子中还发现了其他形式的7肽，包括WRKYGKK、WKKYGQK和WRKYGEK.由于WRKY结构域的数量和锌指基序的氨基酸序列的不同，故将WRKY转录因子分为Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅲ 3组[5].Group Ⅰ包含2个保守的WRKY结构域和1个C2H2锌指结构；
Group Ⅱ与Group Ⅲ都含有1个保守的WRKY结构域，但Group Ⅱ的C端的锌指结构为C2H2，而Group Ⅲ的为C2HC[6-7].同时，Group Ⅱ根据锌指基序差异可进一步分为5个亚组：Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe[5].

目前，WRKY转录因子在非生物胁迫应答中的调控功能已被广泛报道[8].如拟南芥WRKY46、WRKY54和WRKY70转录因子参与了由油菜素内酯调控的植物生长和干旱响应[9]，WRKY25、WRKY26与WRKY33则协同增强了拟南芥植株对热胁迫的耐受性[10].在作物中研究发现，过表达OsWRKY11的转基因水稻幼苗耐热和抗旱性明显增强[11]，在拟南芥中过表达OsWRKY45则增强了其抗病性和耐旱性[12].最近的研究表明，棠梨PbWRKY40转录因子通过直接调控PbVHA-B1的表达来增强转基因植株的耐盐性[13].

甘薯属于旋花科番薯属，具有产量高、抗性强和适应性广等特性，是主要的粮食作物与生物能源作物.世界各地广泛种植甘薯，其中我国是世界上最大的甘薯生产国及消费国.2018年我国甘薯种植面积占世界的29.0%，产量占世界的57.0%，总产量仅次于水稻、小麦和玉米[14-15].然而，盐、旱等胁迫仍显著制约甘薯的产量及品质，因此，培育高抗甘薯新品种具有重要意义.目前，对甘薯中WRKY基因的研究十分有限.Qin等[16]通过对盐胁迫下的转录组测序，从济薯26号和农林54号中鉴定到79个甘薯WRKY基因.研究发现，甘薯IbWRKY2的过表达明显增强了拟南芥的耐盐抗旱性[17].本研究以抗性较强的徐薯22为研究材料，通过转录组分析，从甘薯中筛选出1个受盐胁迫诱导的IbWRKY53L基因，对其进行系统的生物信息学分析，同时利用qRT-PCR检测其对多种非生物胁迫，如盐、PEG6000、冷和热以及不同激素(ACC、ABA、SA和JA)处理的响应特性，旨在为进一步研究甘薯IbWRKY53L基因在非生物胁迫响应中的潜在功能奠定基础.

1.1 植物材料

徐薯22由江苏徐州甘薯研究中心提供.

1.2 实验试剂

RNA提取使用来自天根生物科技有限公司的RNA提取试剂盒，反转录使用的PrimeScript酶、基因克隆使用的PrimeSTARRHS DNA聚合酶、pMD19-T载体以及qRT-PCR所需要的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ均购自大连宝生物(TakaRa)公司.

1.3 RNA的提取和IbWRKY53L基因的PCR扩增、克隆及测序

按照总RNA提取试剂盒说明书提取徐薯22混合组织(根、叶等)的RNA，随后合成cDNA.在Primer Premier 5.0软件中设计IbWRKY53L基因的克隆引物(表1)，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成.PCR反应过程为：98 ℃预变性3 min；
98 ℃变性10 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸90 s，循环30次.随后，通过琼脂糖凝胶电泳进行初步判断，若条带正确，则纯化目的片段并连接到pMD19-T载体，随后转化于DH5α，筛选阳性菌落，送南京擎科生物科技有限公司测序.

表1 基因克隆及qRT-PCR表达分析引物Tab.1 Primers used in cloning and qRT-PCR analysis

1.4 IbWRKY53L基因生物信息学分析

利用一系列在线软件包对IbWRKY53L基因及编码蛋白进行综合生物信息学分析.所用网址见表2.

表2 IbWRKY53L序列生物信息学分析所用在线工具Tab.2 Websites used for bioinformatics analysis of IbWRKY53L sequence

1.5 IbWRKY53L序列的多重比对及进化树分析

结合NCBI中的BlastP在线程序及已有文献报道，首先查找与IbWRKY53L同源的WRKY序列，并通过DNAMAN 5.0进行序列多重比对.随后，对IbWRKY53L蛋白与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、三裂叶薯(Ipomoeatriloba)、玉米(Zeamays)、烟草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)等物种中不同家族的WRKY蛋白序列，使用最大似然法通过MEGA X软件构建进化树，bootstrap值设置为1 000.

1.6 植株的不同非生物胁迫及激素处理

参考孟小庆等的方法[18]，选取生长状况一致的徐薯22幼苗在霍格兰培养液中水培生根，选择长势基本一致的植株进行处理.盐处理：用100 mmol/L NaCl溶液处理植株,收集根样品.干旱处理：用质量分数为20%的PEG6000处理植株,收集根样品.冷处理：将植株放在4 ℃环境,收集叶样品.热处理：将植株放在40 ℃环境,收集叶样品.激素处理:分别用100 μmol/L的脱落酸(ABA)、氨基环丙烷羧酸(ACC，乙烯前体)、茉莉酸(JA)及2 mmol/L的水杨酸(SA)喷施植株，收集叶样品.以上分别在处理0、1、12、24、48 h后收集所需组织的样品.

1.7 甘薯IbWRKY53L基因表达模式分析

按照RNA提取试剂盒说明书提取徐薯22植株在不同胁迫和激素处理下根及叶组织样品的RNA，并反转录合成cDNA.随后，在Primer Premier 5.0软件中设计IbWRKY53L基因的qRT-PCR检测引物，引物序列见表1.以对照、各非生物胁迫及激素处理下的植物cDNA为模版，以甘薯的ARF基因为内参基因[19]，在伯乐CFX96 Real-Time系统(美国)进行qRT-PCR分析.qRT-PCR扩增程序为：95 ℃变性5 s，60 ℃退火1 min,40个循环.随后，用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量.最后,将结果用Origin 8.0软件作柱状图.

2.1 IbWRKY53L基因的生物信息学分析

2.1.1IbWRKY53L基因及所编码蛋白的分子特性分析我们从徐薯22盐处理后的转录组数据中筛选到1个WRKY基因，分析发现,它与课题组从泰中6号中鉴定到的84个IbWRKY蛋白(未发表)中的IbWRKY53蛋白序列相似度最高,为90.1%，这可能是因不同甘薯品种间的序列差异引起的，故将该基因命名为IbWRKY53-like(简写为IbWRKY53L).序列分析表明,IbWRKY53L基因开放阅读框的长度为1 092 bp，编码363个氨基酸残基.

通过NCBI保守结构域预测，结果显示，IbWRKY53L蛋白包含1个290—347位的WRKY保守结构域(图1a)，因此,确定该蛋白属于WRKY转录因子家族成员.ProtParam对IbWRKY53L基因序列编码的蛋白质进行理化性质预测分析表明，该蛋白的理论分子量是39 032.97 Da，为碱性不稳定蛋白(表3).蛋白理化性质中平均疏水系数分析以及ProtScale分析显示,其蛋白疏水区域的面积小于亲水区域面积，说明IbWRKY53L蛋白为亲水性蛋白(表3，图1b).磷酸化位点分析显示,IbWRKY53L蛋白含有潜在的46个丝氨酸(Ser)、7个苏氨酸(Thr)和2个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点(图1c)，这些位点可能发生磷酸化，进而对此蛋白的活性与功能产生一定的调控作用.亚细胞定位发现，该蛋白位于细胞核.另外，预测还发现IbWRKY53L不具有信号肽和跨膜结构域(结果未展示).

表3 IbWRKY53L蛋白理化性质预测Tab.3 Predicted physical and chemical properties ofIbWRKY53L protein

2.1.2 IbWRKY53L蛋白二级及三级结构分析二级结构预测显示,IbWRKY53L蛋白主要由无规则卷曲(67.22%)、α螺旋(19.83%)、延伸链(9.92%)和β转角(3.03%)结构组成(图1d).通过三级结构预测发现，该蛋白具有WRKY转录因子的典型三级结构(图1e).

图1 IbWRKY53L的生物信息学分析Fig.1 Bioinformatics analysis of IbWRKY53L

2.1.3 IbWRKY53L蛋白的多重序列比对及进化树分析用DNAMAN软件对IbWRKY53L与来自多个物种的WRKY蛋白的氨基酸序列进行多序列比对，结果显示，这些蛋白均含有1个高度保守的7肽序列WRKYGQK及1个C2H2型锌指结构，二者共同构成WRKY结构域.其中，IbWRKY53L与甘薯近缘野生种三裂叶薯ItbWRKY7的序列相似性最高，达到96.2% (图2)，三裂叶薯可能是甘薯近缘野生种支撑了该结果.

保守的7肽序列WRKYGQK及C2H2型锌指结构分别用红色和蓝色方框标识图2 IbWRKY53L蛋白的多重序列比对Fig.2 Multiple sequence alignment of IbWRKY53L protein

将IbWRKY53L蛋白序列与拟南芥、玉米等不同物种的不同家族的WRKY蛋白构建系统进化树，结果表明,IbWRKY53L与Ⅱd亚组的拟南芥AtWRKY11及AtWRKY17聚在同一分支[5]，因此，其属于WRKY家族中的Ⅱd亚组(图3).另外，除了三裂叶薯ItbWRKY7之外，与IbWRKY53L同源关系较近的为牵牛花InWRKY7蛋白，二者蛋白序列相似性为93.5%.

IbWRKY53L用红色方框标识.图3 IbWRKY53L蛋白的进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of IbWRKY53L protein

2.2 IbWRKY53L基因在多种非生物胁迫处理下的表达特性分析

采用qRT-PCR技术分析IbWRKY53L基因在盐、PEG6000、冷及热胁迫处理下的相对表达量,结果显示，在盐与热胁迫处理下，IbWRKY53L基因的表达量与对照组相比都在1 h达到高峰，分别为对照的1.5倍和2.6倍.冷胁迫下，基因的相对表达量呈现先降后升的趋势，在1 h时最低，而后开始上调，在24 h及48 h时,相对表达量约为对照的1.6倍.相反，PEG6000处理下，基因的相对表达量呈现下降的趋势(图4).

图4 qRT-PCR检测不同非生物胁迫处理下IbWRKY53L基因的表达水平Fig.4 Identification of the expression of IbWRKY53Lgene under different abiotic stresses by qRT-PCR

2.3 IbWRKY53L基因在不同激素处理下的表达特性分析

qRT-PCR技术分析表明,ABA处理后12 h可上调IbWRKY53L基因的表达，诱导水平约为对照的1.75倍.JA与SA处理以呈现上升的趋势诱导IbWRKY53L基因的表达，48 h时的表达量分别为对照组的2.5倍和2倍.但ACC处理下的表达量随着时间的延长，呈现下降趋势(图5).

图5 qRT-PCR检测不同激素处理下IbWRKY53L基因的表达水平Fig.5 Identification of the expression of IbWRKY53Lgene under various hormones by qRT-PCR

总的来说，IbWRKY53L基因对4种激素及盐、旱、冷、热这些胁迫都有一定程度的应答.

非生物胁迫是影响甘薯产量的重要因素之一，在长期进化过程中,甘薯已形成复杂的调控机制，能够在各种胁迫下生存，但产量和品质依然受到多种非生物胁迫的制约[20].研究表明，WRKY可以通过调控胁迫相关基因的表达或者通过ABA、ROS等相关的信号通路调节植物的胁迫耐受性[21].首个WRKY编码基因SPF1于1994年在甘薯中被发现后[22]，大量不同物种的WRKY家族的基因被广泛鉴定，如已分别在拟南芥、水稻和小麦中鉴定到74、102和124个WRKY基因[23-24].目前，对WRKY转录因子的功能研究主要集中在拟南芥和水稻等模式植物中，但在重要的粮食作物甘薯中研究不足.因此，在抗性强的非模式作物甘薯中进行深入的探究是必要的，这将为抗逆遗传改良提供理论依据.

通过生物信息学分析发现，我们筛选到的IbWRKY53L蛋白定位于细胞核，这与它作为转录因子的预期结果一致.另外，IbWRKY53L为亲水性蛋白，无信号肽与跨膜结构域，故排除它为分泌蛋白，这与许多WRKY蛋白的结论一致.另外，通过表达检测发现，IbWRKY53L基因受到盐、冷和热胁迫的诱导.之前的许多报道表明，胁迫响应的WRKY基因广泛参与对多种植物非生物胁迫耐受性的调节[6,8].例如，小麦TaWRKY75-A基因受盐、旱等多种非生物胁迫的诱导[24]，类似的情况在拟南芥WRKY25/26/33及水稻OsWRKY45/72基因中也被发现[6,10,12].此外，研究结果表明，来自同一亚组的WRKY成员可能具有相似的功能，例如Ⅱd亚组的AtWRKY39与热耐受性密切相关[6,25].这些发现进一步表明，同为Ⅱd亚组的IbWRKY53L可能参与非生物胁迫耐受性.

另外，WRKY转录因子被证实是连接植物激素信号(ABA、JA和SA等)以响应环境压力的关键调节因子[6,25],如拟南芥WRKY57被证实通过直接调控ABA信号相关的RD29A和NCED3基因来提高拟南芥的耐旱性[26].胁迫激素ABA能够上调IbWRKY53L的表达，推测它可能通过依赖于ABA的信号途径参与胁迫响应.激素JA和SA在植物应答病原体和非生物胁迫的防御反应中均起着关键作用[27]，比如OsWRKY45在SA介导的防御反应中扮演关键角色，其过表达显著增强了水稻的稻瘟病抗性[28].IbWRKY53L基因的表达受JA和SA的诱导，暗示它可能也参与甘薯病原体感染等生物胁迫应答，但这还需要进一步的实验证实.这些研究结果为继续探究IbWRKY53L基因在甘薯胁迫应答中的潜在功能奠定了基础.

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