鼻息肉组织相关受体表达与Eos浸润相关性

赵 冉 许建华

鼻腔组织高度水肿是鼻息肉的主要表现，发病率为1%～4%[1]。鼻黏膜嗜酸性粒细胞(eosinophils，Eos)浸润增多是鼻息肉发病的主要病理基础之一，可致鼻息肉组织微环境失调，加重鼻息肉病情[2]。白介素-5(interleukin-5，IL-5)可通过刺激Eos前体细胞的增殖、分化来调节Eos浸润程度，是Eos的重要趋化因子[3]。芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)可与配体相结合参与多种免疫反应过程并调节机体功能，与哮喘、特异性皮炎和类风湿性关节炎等自身免疫疾病的发病密切相关[4]。维甲酸相关孤儿受体(retinoic acid-related orphan γt，RORγt)是小鼠及人类辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)主要转录因子，通过促进Th17细胞分化和特异性表达分泌参与癌症、感染性疾病和免疫疾病的发病过程[5]。既往研究[6]指出，IL-5可刺激Eos生物学活性继而影响鼻息肉发病。但AhR、RORγt等细胞因子是否同样与Eos浸润以及鼻息肉发病机制有关目前尚不明确。本研究对鼻息肉患者息肉组织中IL-5、AhR和RORγt表达水平进行检测，分析其与Eos浸润程度之间的关系，以深入了解鼻息肉的发病机制，为临床治疗鼻息肉提供参考。

1.1 一般资料 选取2021年3～12月重庆医科大学附属渝北医院耳鼻喉科收治的37例鼻内镜下行鼻窦手术切除的鼻息肉患者作为息肉组，同期20例行单纯鼻中隔偏曲矫正术的中鼻甲黏膜患者作为正常组。两组患者性别、年龄、病程等一般资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)。按照浸润程度不同将患者分为I度浸润组(n=11)、Ⅱ组浸润组(n=17)和Ⅲ度浸润组(n=9)，Ⅰ度浸润组男性7例，女性9例，年龄(32.10±2.85)岁；
Ⅱ度浸润组男性9例，女性8例，年龄(32.18±3.11)岁；
Ⅲ度浸润组男性5例，女性4例，年龄(32.15±2.79)岁，3组患者性别、年龄等一般资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经重庆医科大学附属渝北医院伦理委员会批准(伦理批号：ZCYLC20200815)。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①息肉组患者均符合《慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南》[7]中指出的鼻息肉相关诊断标准；
②所有患者均经术前鼻内窥镜检查、CT检查及术后病理检查证实为鼻窦炎鼻息肉或鼻中隔偏曲者；
③临床资料完整，均留取鼻息肉或鼻黏膜组织待测者。排除标准：①近1个月内接受过糖皮质激素、类固醇激素及抗组胺药物治疗者；
②近1周内并发急性呼吸道感染者；
③合并变异性鼻炎、真菌性鼻窦炎；
④合并哮喘患者。

1.3 样本收集及保存 息肉组患者均于鼻内窥镜视野下钳取3 mm×3 mm的息肉头端组织，正常组研究对象取距鼻甲头端上缘4～5 mm处的正常黏膜组织，生理盐水洗去杂质后用洁净的纱布蘸干水分，以4%多聚甲醛固定24～48 h，取其中一部分以石蜡包埋后制成组织切片，另一部分于4℃条件下保存于70%乙醇溶液中。

1.4 检测方法

1.4.1 实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative Real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)[8]取经上述方法处理后的两组研究对象冷冻鼻息肉组织及鼻黏膜组织，以Trizol试剂提取组织中的总RNA，采用反转录试剂盒(上海康朗生物科技有限公司，货号：KL-170403-10)将样本中的总RNA逆转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR仪(美国Invitrogen公司，型号：ABI 7500)进行qRT-PCR，以β-actin(上海艾博抗公司，货号：ab8226)为标准化内参检测鼻息肉及鼻黏膜组织中IL-5和AhR的表达水平。见表1。

表1 IL-5和AhR引物设计

1.4.2 苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)和免疫组织化学法 取经上述方法处理后的两组研究对象鼻息肉及鼻黏膜组织石蜡切片，均行HE染色和RORγt免疫组化[9]。石蜡标本脱蜡水化后以pH值为7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，以枸橼酸盐缓冲液高温高压修复抗原，室温下与3%过氧化氢溶液共同孵育10 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，与50 μL的RORγt一抗室温下共同培养1 h，磷酸盐缓冲液冲洗3次，滴加50 μL的聚合物增强剂，室温下共同培养20 min后磷酸盐缓冲液再次冲洗3次，与50 μL酶标鼠抗兔聚合物室温下共同培养30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次。加入DAB显色液共同培养5 min，电镜下观察到棕黄色或黄色即为阳性显色。苏木精染色液复染后以0.1%氯化氢溶液分化，流水冲洗后氨水返蓝，梯度乙醇脱水后透明封片，晾干后电镜下观察。

1.5 观察指标 ①病情程度：参考《慢性鼻-鼻窦炎诊断和治疗指南》[7]和文献[10]对所有研究对象进行视觉模拟量表(visual analog scale，VAS)评分、CT评分和内镜评分；
②实验室指标：观察并比较两组研究对象鼻息肉组织和鼻黏膜组织中IL-5、AhR、RORγt和Eos计数，依据400倍镜视野下100个炎性细胞中Eos计数水平计算Eos浸润程度，将浸润指数为0%～33%视为I度浸润，浸润指数为34%～66%视为Ⅱ度浸润，浸润指数为67%～100%视为Ⅲ度浸润[11]。比较不同浸润程度患者鼻息肉组织IL-5、AhR和RORγt表达水平，并分析鼻息肉组织IL-5、AhR和RORγt表达水平与Eos浸润程度之间的相关性。

2.1 两组研究对象VAS评分、CT评分和内镜评分比较 息肉组患者VAS评分、CT评分和内镜评分均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组研究对象VAS评分、CT评分和内镜评分比较分)

2.2 两组研究对象IL-5、AhR和RORγt表达水平比较 息肉组患者鼻息肉组织中IL-5、AhR和RORγt表达水平均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图1。

表3 两组研究对象IL-5、AhR和RORγt表达水平比较

图1 两组研究对象IL-5和AhR的mRNA表达水平比较

2.3 两组研究对象嗜酸性粒细胞浸润程度比较 息肉组患者Eos计数和Eos密度均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图2。

表4 两组研究对象嗜酸性粒细胞浸润程度比较

2.4 不同浸润程度患者鼻息肉组织IL-5、AhR和RORγt表达水平比较 3组不同浸润程度患者息肉组织中IL-5、AhR和RORγt表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

注：A为息肉组；
B为正常组；
箭头所示为嗜酸性粒细胞。

表5 不同浸润程度患者鼻息肉组织IL-5、AhR和RORγt表达水平比较

2.5 鼻息肉组织IL-5、AhR和RORγt表达水平与嗜酸性粒细胞浸润程度的相关性 鼻息肉组织中IL-5、AhR和RORγt表达水平与Eos计数及Eos密度均呈正相关关系(P<0.05)。见图3。

注：IL-5为白介素-5，AhR为芳香烃受体，RORγt为转录因子维甲酸相关孤儿受体，EOS为嗜酸性粒细胞。

鼻息肉是指鼻腔及鼻窦黏膜并发慢性炎症性疾病，患者临床表现为单侧或双侧持续性鼻塞、流涕且伴有渐进性加重，部分患者还因息肉阻塞鼻道、咽鼓管等部位引发嗅觉减退、耳鸣和听力下降[12]。现阶段临床治疗鼻息肉多采用糖皮质激素辅助鼻内镜切除手术方式，但存在易复发问题[13]。本研究从鼻息肉发病机制出发，探讨息肉组织与正常黏膜组织中IL-5、AhR、RORγt表达和Eos浸润差异，分析IL-5、AhR和RORγt与Eos浸润之间的关系，旨在为临床治疗鼻息肉提供更多思路。

本研究结果显示，息肉患者各项评分、组织标本在IL-5、AhR、RORγt表达和Eos浸润程度均高于正常组，且3组不同浸润程度患者息肉组织中IL-5、AhR和RORγt表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，表明IL-5、AhR和RORγt在鼻息肉患者Eos浸润及发病过程中发挥重要作用。IL-5是诱导Eos浸润的主要炎性细胞因子[14]，AhR可与小分子配体结合促进Th17细胞产生白介素-17等炎性介质[15]，RORγt可与信号转导和转录激活因子5结合加速Th17释放炎性细胞因子[16]。Eos浸润是导致鼻息肉加重的重要病理基础，趋化的Eos大量聚集于临近息肉组织，引起IL-5、白介素-17等炎性细胞因子大量释放，加速中性粒细胞聚集，并持续作用于上皮细胞、成纤维细胞、基底膜及呼吸道黏膜，使得息肉附近血管通透性增加，EOS浸润和息肉病情进行性加重[17]。因此，鼻息肉组织中Eos浸润程度不同，IL-5、AhR和RORγt表达水平也不同。

本研究发现，鼻息肉组织中IL-5、AhR和RORγt表达水平与Eos计数及Eos密度均呈正相关关系，这与李帅祥等[18]研究结论相似。IL-5作为诱导Eos浸润发生的最关键因子，对于鼻息肉组织中Eos浸润增加具有重要调节作用，可与Th17细胞协同作用加重Eos浸润[19]。AhR可与其受体结合参与Th17炎性反应的发生，与低浓度的转化生长因子-β和IL-5、白介素-6相互作用，上调细胞及组织中RORγt的表达，诱导TH17细胞分化，使Th17反应增强，诱导基质细胞分泌大量的白介素-6、前列腺素E2、一氧化氮等炎性介质，增厚鼻息肉组织基底膜，加速基质纤维化进程和组织结构重塑，引起鼻腔黏膜慢性炎症性损伤[20]，进一步增加Eos浸润，引起鼻息肉组织中Eos计数和密度增加[21]。

综上所述，鼻息肉组织中IL-5、AhR和RORγt水平与Eos浸润程度有关，监测上述细胞因子的表达可作为预测和判断Eos浸润和鼻息肉发病的有效指标，对于鼻息肉的临床诊治有较高的指导价值。

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