克隆动物存在的问题

陈怡鑫，徐亚幸，黄东俊

(广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东 广州 510303)

“Clone”这一词源自于希腊，原指用幼苗或枝条以无性繁殖的方式进行扦插，即通过无性繁殖方式由单个细胞或个体得到基因型与供体完全相同的新个体。动物克隆是近年来生物学领域中备受关注的一门生物学高新技术，是指由一个动物的细胞经过无性繁殖而产生的遗传上与细胞核的供体相同的动物个体[1]；
该技术是一门涉及细胞工程学和胚胎工程学的生物技术[2]。最早的克隆动物是由1996—1997年基思·坎贝尔和伊恩·威尔穆特等使用羊的胚胎成纤维细胞和动物乳腺上皮细胞产生的克隆羊，克隆羊Dolly 的问世标志着克隆动物的时代拉开了序幕。近年来，克隆牛、克隆山羊和克隆猪等克隆动物相继问世[3]。克隆动物领域不断发展和进步，但是有关克隆动物的问题也随之而来，如克隆动物技术问题、克隆动物食品安全问题、克隆动物制约问题等。本文对动物克隆技术中有待解决的问题、与克隆动物食品安全相关的问题、克隆动物相关制约问题等关键问题进行了较为系统的介绍，旨在阐明目前在动物克隆技术发展过程中所存在且未解决的问题，为进一步研究克隆动物提供研究方向的参考。

1.1 克隆动物效率低

融合率是指不同基因型的原生质体或细胞融合形成杂种细胞的融合成功率；
胚胎发育率是指从受精卵形成到胚胎出离卵膜的成功率；
产仔率指的是本年度内出生仔畜累计数量对上年度终受胎母畜数的百分率。因此，克隆动物的总体效率可以通过以下的计算方式进行粗略的计算。

到目前为止，新闻报道过少数克隆动物具有较高的成功率，但是被公认的克隆动物成功率仅有1%～3%，而克隆动物在胚胎移植后的出生率甚至不到10%[5]。目前来说，克隆动物研究获得的最高效率的是Kato 等在研究克隆牛时获得的，此次研究获得的总效率为13.8%；
但是，在随后进行的有关克隆动物的研究中，他们获得的总效率不到4%[6]。之所以会出现克隆动物总体效率较低的情况，是因为在克隆动物的过程中细胞核来源于高度分化的体细胞。在细胞分化的过程中，体细胞的细胞核内的遗传物质获得了DNA 和染色质的表观修饰，促使细胞处于分化状态。因为供体细胞的细胞核需要植入减数第二次分裂时期的卵母细胞进行克隆胚胎的发育，所以供体细胞的细胞核必须进行相应的表观遗传修饰的重编程，激活与克隆胚胎早期发育有关的基因，促进有关基因的表达，并抑制与分化相关的基因的表达，从而获得发育的全能性，产生克隆动物个体。克隆动物总效率低下的主要原因可能是供体细胞细胞核的重编程不能完全进行，从而导致在克隆动物发育过程中存在部分起关键作用的基因没有表达或表达异常[7]。

1.2 重构胚胎植入后存活率低

重构胚胎植入动物的子宫后，胚胎的流产现象较为严重[4]。杨向中等的研究表明，在7 日龄的重构胚胎中，克隆动物重构胚胎的基因表达已经和供体细胞的基因表达存在较大的差别，且与人工授精产生的动物胚胎的基因表达极为相似，其相似的程度超过了人工授精胚胎和试管胚胎的相似程度。在杨向中等研究的有关动物胚胎的5 000 多个基因中，仅有不到50 个基因在克隆动物胚胎中的表达和在人工授精产生的胚胎中的表达出现了2 倍以上的区别；
此项研究表明，克隆动物的重构胚胎在克隆后经过染色质的重编程与正常胚胎的基因表达十分相近[8]。克隆动物重构胚胎植入存活率低可能是在后期的克隆动物重构胚胎发育过程中出现的。

张德福等认为，克隆动物重构胚胎在母体中流产可能是因为胎盘发育异常。胎盘是母体与胚胎进行气体交换、营养输入及代谢废物交换的主要场所，除此基本作用之外，胎盘还会通过分泌与妊娠相关的激素、生长因子和胎儿免疫蛋白等物质促进胚胎的发育。然而，克隆动物重构胚胎常常出现胎盘异常肥大的现象，但是可用于母体和胚胎进行有效交换的部位却有所减少，致使克隆动物胚胎在发育过程中胎盘功能异常，进而导致胚胎流产。就克隆牛而言，在克隆牛胚胎从30～90 d 的发育过程中，胚胎的胎盘小体经常发育异常，胎盘中的血管发育和胎盘子叶的数目会逐渐减少，并且胎盘上还具有一些血管化程度较低的尿囊和不正常的绒毛上皮[9]。克隆动物重构胚胎植入后存活率低的主要原因可能是因为胚胎的胎盘发育异常导致。

1.3 供体细胞的细胞核与受体细胞的细胞质相互作用的协调性

供体细胞的细胞核与受体细胞的细胞质的相互协调与同步是影响细胞核重编程的关键因素之一，因此如果使受体细胞与供体细胞处于相同的细胞周期，克隆动物的成功率就会大大提高[10]。克隆羊Dolly 之所以能够产生，是因为伊恩·威尔穆特和基思·坎贝尔等找到了一种使供体细胞的细胞核和受体卵母细胞更为相容的方法，进而促使供体细胞核在DNA 复制时间上与受体卵母细胞基本同步，即处于同一时期。

目前认为，受体细胞的细胞质是处于减数第二次分裂期的卵母细胞，除了DNA 合成期外，其他各个时期的细胞均可作为细胞核的供体[11]。因为减数第二次分裂时期的卵母细胞内含有的卵细胞促进成熟因子(maturationpromoting factor，MPF) 会导致处于DNA 合成期的细胞以及处于RNA 复制和有关蛋白质合成时期的细胞发生早熟染色体凝聚和核膜破裂，然后经过细胞核的重编程、DNA 复制和染色体倍数的增加，进而造成克隆动物重组细胞无法继续正常发育[12]。

1.4 受体线粒体对克隆动物的影响

在动物细胞核移植重构胚胎的过程中，供体核会连同自身细胞的细胞质带入受体细胞，导致克隆动物的线粒体成为杂合型，其既含有供体细胞所带入的线粒体，也含有受体细胞质本身所具有的线粒体，所以通过核移植产生的克隆动物重构胚胎实际上是一种遗传嵌合体[1]。

研究表明，随着克隆动物重构细胞的发育，受体细胞的线粒体可能存在以下三种情况。一是受体细胞的线粒体随着克隆动物重构细胞卵裂发育而逐渐减少，供体细胞细胞质中的线粒体占主导地位。二是受体细胞的线粒体随着克隆动物重构细胞的卵裂发育而不断增加，供体细胞细胞质中的线粒体逐渐减少，最终受体细胞的线粒体占主导地位；
三是供体细胞和受体细胞两者的线粒体共存，两者均未出现增多和减少[13]。

1.5 DNA 甲基化/去甲基化对克隆动物的影响

基因组遗传修饰和基因组功能调节的主要方法是DNA 的甲基化。DNA 与蛋白质的作用可以被基因组甲基化所改变，导致非编码序列和发育相关基因处于隐性的可遗传机制。细胞核重编程需要打破这种基因处于隐性的状态，只有在供体细胞核移入后，重构胚胎基因转录之前进行细胞核重编程，才能恢复受体细胞内基因的活性[14]。

甲基化的DNA 会阻碍基因的正常表达，且甲基化的DNA 会被特殊的蛋白质识别并稳定结合，这些特殊的蛋白质可以和转录共阻遏因子结合，导致核小体组蛋白的N 端的乙酰基被脱除，进而阻碍重构细胞的转录过程。在克隆动物重构胚胎发育的早期，DNA 开始甲基化，并且后续甲基化的水平会逐渐升高[15]。故想要成功地产生克隆动物，DNA 甲基化的可逆性研究是十分必要的。

1.6 克隆动物的端粒问题

端粒是染色体端部许多重复的短序列核苷酸所组成的具有高度保守性的特化部分。因为端粒无黏性，所以可以防止染色体黏着。细胞的遗传物质每复制一次，端粒的核苷酸数量就会减少并且缩短。端粒的自我复制要靠端粒酶，但是正常的细胞缺乏端粒修复酶，故端粒随细胞分裂而变短，导致细胞分化程度较高后易衰老[3]。克隆羊Dolly 的染色体端粒较短，可能是Dolly 寿命较短的原因之一[16]。而影响染色体端粒长短的原因共有五种，第一种是由于物种不同所导致的端粒长度不同；
第二种是培养代数较少的细胞染色体端粒较长；
第三种是不同种类的细胞的染色体端粒长度不等；
第四种是DNA 的重组机制导致端粒延长；
第五种是表观遗传修饰对染色体端粒长度的影响[16]。

动物的染色体端粒分布较广，而端粒长度是否关系到克隆动物的寿命，能否准确地反映克隆动物的实际生理年龄，还需要进一步的证实[13]。

1.7 X 染色体失活问题

失活雌性动物的一条X 染色体可以实现雌、雄哺乳动物的基因剂量补偿。正常情况下，未着床胚胎细胞的两条X 染色体都能够活动。后来，上胚层中X 染色体会随机失活，而滋养层细胞则会失活父系的X 染色体[3]。死亡克隆动物胎盘的X 染色体会被随机灭活，但是活体克隆动物的胎盘为父系X 染色体灭活。

1.8 克隆技术条件有待完善

克隆动物的研究已经在技术优化、理论基础以及实际应用等方面取得较大的发展，但是目前克隆动物的技术还不够成熟，克隆动物机理性的相关理论研究水平也不够高。要不断完善动物克隆技术，还需要遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的支撑，以及在细胞核供体和卵细胞的选材、重组胚胎的激活方式、核质比的选择、是否需要进行连续核移植等技术方面均需进一步研究[17]。要提高动物克隆的成功率以及提高它们的存活率和延长其寿命还需科学家们不懈的努力，提升技术条件。

2.1 克隆动物食品的安全

欧洲食品安全局曾在2009 年9 月17 日声明，克隆动物的肉、奶和它们后代所产的肉和奶在食品安全方面与普通家畜并无差异[18]。美国食品与药品管理局也曾表明，危险评估主要集中于克隆动物自身，而不是有关克隆动物的食品以及有关克隆动物后代的食品。有文献报道，认为有关克隆动物的食品以及有关克隆动物后代的食品是不存在安全问题的[19]。但是目前为止，克隆动物尚未到达食用阶段，更多的用于研究。

2.2 克隆动物食品的营养性

2.2.1 克隆动物食品——奶的营养性

动物的乳汁是一种富含营养的食品，含有很多人所需要的蛋白质、脂肪等营养物质。与非克隆动物的乳汁相比，克隆动物所产的乳汁所含的蛋白质和脂肪都有小幅度的减少，但是其蛋白质和脂肪的含量依旧处于正常的范围。如果就克隆动物个体之间的乳汁营养含量而言，蛋白质和脂肪含量的变化幅度甚至小于非克隆动物[20]。

2.2.2 克隆动物食品——肉的营养性

科学家对克隆动物所产肉的营养性进行了一系列研究。研究表明，相对于非克隆动物所产的肉来说，克隆动物所产的肉含有更多的多不饱和脂肪酸，单不饱和脂肪酸的含量有所下降[20]。因为人体所需的脂肪酸多为多不饱和脂肪酸，所以从营养学的角度来看，克隆动物所产的肉可能更适合人食用。

2.3 有关克隆动物食品的法律

随着克隆动物技术的发展，有关克隆动物的食品也逐渐流向市场，随之出现的是有关克隆动物食品的流通问题。据此，学者贾晋杰提出几条解决有关克隆动物食品流通问题的建议。第一是我国需要提升克隆动物食品生产的许可制度；
第二是我国应建立适度的克隆动物食品生产过程的操控系统；
第三是建立克隆动物食品的溯源制度；
第四是保护公众知情权。让公众知晓自己所购买的是有关克隆动物的食品[21]。我国应参考欧美国家所持的“谨慎防御”的原则，建立我国较为完善的有关克隆动物食品的监管部门和制度。不过到目前为止，克隆动物尚未到达食用的标准。

3.1 克隆动物及其产品的专利性认定问题

在认定克隆动物及其产品的专利的过程中会出现一些无法避免的问题，而这些问题的解决方式有三种。一是专利的申请人请审查员或当地有关检测机构前往产品处进行考查核实；
二是提供专利申请人所产的有关克隆动物的基因组图谱；
三是保存繁殖的材料。可以通过微生物的保存方式进行有关克隆动物的卵子、精子以及体细胞的保存。如果这些想法能够得到有效的实施，那么有关克隆动物新种的保护问题将会被解决[22]。

3.2 有关克隆动物技术方面的规定

最早对克隆动物技术做出相应的法律明文规定的国家是英国，例如使用克隆动物胚胎的相关研究需经过英国行政机构的认可才能进行研究，并且禁止将克隆动物的胚胎植入人体内，也禁止将人的胚胎植入动物体内等[23]。

尽管克隆动物的发展取得了较大的成就，但是由克隆动物引发的或克隆动物涉及的相关问题不能被忽视。在各国科学家的共同努力下，对克隆动物技术的研究会进入一个更高的水平，克隆动物食品能够被广大群众所接受，与此同时克隆动物的技术必将能够造福于人类社会，促进人类文明的进步。

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