周 日，王晨光，卢革宇
（吉林大学 电子科学与工程学院 集成光电子学国家重点实验室, 吉林 长春 130012）
脂滴是一种球形细胞器，它的内部是由甘油三酯和胆固醇酯等构成的中性脂质核，核外包覆着嵌有多种蛋白的磷脂单层膜。脂滴广泛存在于绝大部分真核细胞中，主要位于细胞质中；
少部分类型细胞的细胞核中也存在着脂滴分布[1-2]。关于脂滴的生物起源，目前被普遍接受的假设是脂滴来源于内质网，其在蛋白的调控下，以出芽的方式从内质网的膜结构中脱落，从而进入细胞质中形成新生脂滴[3-5]。该假设的形成主要是基于脂滴生长所需的中性脂质的合成酶都是在内质网中被发现的[6]。在不同类型的细胞中，脂滴尺寸差别较大，如在脂肪细胞中，脂滴直径约10～200 μm；
在棕色脂肪组织、肝脏以及心脏中，脂滴直径约为0.1～1 μm；
对于刚从内质网脱落的新生脂滴，其直径只有30～60 nm。脂滴之前一直被认为是细胞内惰性脂肪堆积颗粒。但随着对脂滴研究的逐渐深入，人们认识到脂滴是一种重要的细胞器，在脂质存储、膜合成及转运等细胞生物学过程中起重要作用。此外，脂滴还参与细胞内蛋白存储、病毒复制、以及炎症反应等活动[7-9]。糖尿病、神经退行性疾病、肥胖症、以及癌症等与上述生理活动过程相关的各种代谢类疾病也都跟脂滴的功能紊乱密切相关[10-13]。因此，脂滴研究已然成为细胞生物学领域最受关注的研究方向之一。
为了使脂滴结构及分布可视化，有学者研究了脂滴在细胞中的复杂生理功能，荧光成像技术因其高空间分辨率、高实时性、无辐射和无需样品侵入等优点而被广泛采用[14-16]。在众多荧光成像技术中，宽场显微镜和共聚焦显微镜是观察研究脂滴最常用的工具。但由于光学衍射极限的限制，两者的分辨率只能达到250 nm左右，这对于观察小脂滴，尤其是新生脂滴来说是远远不够的[14-16]。无需荧光标记就可以实现对脂滴长期动态追踪的相干反斯托克斯拉曼散射显微镜同样受到光学衍射极限的限制，成像分辨率不足[17-18]。具有高分辨率的电子显微镜因为具有样品侵入性，无法提供活细胞内脂滴的实时信息。
在这种情况下，近年来新兴的各种能够打破光学衍射极限的超分辨荧光显微镜成为纳米尺度研究活细胞小脂滴，尤其是新生脂滴最有力的工具[19-49]。目前，已成功用于细胞脂滴荧光成像的超分辨显微镜有受激发射损耗显微镜（STED）[19-26]、结构光照明显微镜（SIM）[27-30]和光激活定位显微镜（PALM）[31-33]。它们根据不同的原理巧妙地绕开了光学衍射极限的限制，实现了脂滴的超分辨成像。本文将简单介绍这几种超分辨显微镜的工作原理，讨论其对荧光探针光物理性质的特殊要求，并进一步系统总结脂滴超分辨成像荧光探针的研究进展。在众多的荧光探针材料体系中，如有机小分子、有机或无机纳米粒子、荧光蛋白等，有机小分子荧光探针具有结构组成明确、发光性质易于精准调控、尺寸小、细胞膜通透性高、标记靶向性好等优势，因此受到广泛关注。目前用于细胞脂滴超分辨成像的荧光探针，也基本全是有机小分子。有机小分子荧光探针选择性标记细胞脂滴是基于物理化学领域的“相似相容原理”，一般具有较为疏水的特性。与此同时，本文将分析对比不同超分辨显微镜在脂滴荧光成像方面的优势与不足，并对其发展趋势进行展望。
STED显微镜成像原理由德国S. W. Hell教授于1994年首次提出[50]，并于1999年在其搭建的STED成像系统中得到实验证实[51]。STED显微镜成像的基本原理如图1（彩图见期刊电子版）所示。
图1 STED超分辨显微镜原理Fig. 1 The principle of the STED super-resolution microscope
该超分辨显微镜是在激光扫描共聚焦显微镜的基础上改造所得，其采用两束激光，一束激发光将荧光分子从基态S0激发至激发态S1，然后间隔较短的时间（ps级）再施加另外一束环形损耗光，即STED激光，照射光斑环形区域内的荧光分子，使它们通过受激辐射方式从激发态S1返回基态S0，呈现在检测器上的荧光信号就只剩位于环形损耗光中空区域的荧光分子自发辐射形成的光斑，从而实现超分辨成像。通过点扩散函数（PSF）的抑制作用，使得位于环形区域内的荧光分子从荧光亮态转换成了荧光暗态。理论上，STED环形损耗光功率越高，它的中空区域面积就越小，得到的半峰全宽分辨率就越高。STED超分辨成像的分辨率d可表示为：
式中Isat是荧光探针在一定波长的STED环形损耗光下具有的饱和强度，定义为荧光探针的信号强度被损耗到一半时所用的STED环形损耗光强度；
I为成像时所施加的STED环形损耗光强度；
NA为显微镜的数值孔径；
λ为激发光波长。STED超分辨成像技术是一个物理过程，成像速度快，时间空间分辨率高，不需要额外施加算法以及图片后处理等复杂的步骤。为了得到较高的分辨率，通常需要使用很强的STED损耗光，其功率密度一般在101～102MW cm-2范围内。如此高的强度通常会对所使用的荧光探针产生严重的光漂白（即荧光信号迅速消失）[52-54]，因此该成像技术对荧光探针的光稳定性要求非常严苛。除此之外，STED显微镜对荧光探针的吸收发射区间、损耗特性也有一定的要求。常用的STED损耗光有3种，分别位于592 nm、660 nm和775 nm处。对于荧光探针来说，所选用的STED损耗光要尽量远离吸收光谱，这样可以避免再激发过程。同时也要与发射光谱有较大的重叠，以保证具有较大的损耗截面。此外，荧光探针还需要具有优异的损耗特性，即易于发生受激辐射过程。在这种情况下，具有大斯托克斯位移的有机荧光探针在STED超分辨成像中备受青睐。
STED超分辨成像要求所用荧光探针具有高光稳定性、良好的受激辐射特性以及合适的吸收发射光谱性质。为了增强有机小分子荧光探针的光稳定性，常用的策略有两种：一是通过在分子骨架上引入吸电子基团来降低LUMO能级，从而有效提升荧光分子的光稳定性[55-56]；
二是通过构筑并环结构抑制双键异构，从而提升光稳定性[57-58]。Taki等人通过在梯形的双噻吩并苯π共轭骨架上以氧化噻吩环上硫原子的方式引入强吸电子基团，基于该设计策略得到了具有高光稳定性的脂滴荧光探针LAQ1（图2）[19]。与脂滴商用染料BODIPY 493/503相比，LAQ1的光稳定性得到显著提升。将该荧光探针用于多色荧光成像，成功在内质网膜上捕获到了小的脂滴，为脂滴的生物起源提供了直观证据（图3（a）～3（b），彩图见期刊电子版）。高的光稳定性以及给受体结构带来的大斯托克斯位移使得荧光探针LAQ1适用于STED超分辨成像。在STED成像中，LAQ1染色
图2 用于脂滴STED超分辨成像的有机荧光探针Fig. 2 The organic fluorescent probes for STED super-resolution imaging of lipid droplets
图3 脂滴荧光探针LAQ1在多色共聚焦成像和STED超分辨成像中的应用。（a）脂滴、内质网和线粒体的三色荧光成像；
（b）穿过白色箭头的信号强度分布；
（c）小脂滴的STED成像；
（d）穿过同一小脂滴的共聚焦和STED成像信号强度图[19]Fig. 3 The applications of lipid droplets fluorescent probe LAQ1 in multicolor confocal imaging and STED super-resolution imaging. (a) Three-color fluorescence imaging of lipid droplets, endoplasmic reticulum and mitochondria; (b) signal intensity profiles across the white arrow; (c) STED imaging of lipid droplets; (d) confocal and STED imaging signal intensity profiles across the same lipid droplet[19]
的细胞脂滴分辨率达166 nm，打破了光学衍射极限的限制，明显低于共聚焦模式下的分辨率245 nm（图3（c）～3（d））。另外，较高的光稳定性使得荧光探针LAQ1能够用于长时间三维成像，在7 h内成功监测到了脂滴内脂质的分解以及随之而来的脂质生成过程。荧光探针LAQ1的设计策略对于研制新型高光稳定性脂滴荧光探针具有一定的指导意义。
Tang等人研制了具有聚集诱导发射（AIE）特性的脂滴荧光探针DTPA-BT-M[20]，其具有较大的双光子吸收截面（1 581 GM）和大的斯托克斯位移。该荧光探针一方面可以用于细胞脂滴STED超分辨成像，在STED成像模式下能够实现95 nm的分辨率（图4（a），彩图见期刊电子版）；
另一方面也可以用于细胞脂滴双光子荧光成像，组织穿透深度可达300 μm（图4（b），彩图见期刊电子版）。与传统的共聚焦以及宽场显微镜相比，95 nm的分辨率已经得到了较大的提升，但是该分辨率对于观测脂滴尺寸在100 nm左右以及更小的新生脂滴（30～60 nm）来说[1-5]，仍然略显不足。
图4 脂滴荧光探针DTPA-BT-M在（a）STED超分辨和（b）双光子成像中的应用[20]Fig. 4 The applications of lipid droplets fluorescent probe DTPA-BT-M in (a) STED super-resolution and (b) two-photon imaging[20]
如何进一步提升细胞脂滴STED超分辨成像的分辨率，最大程度地发挥STED成像技术的潜力?首先，使用荧光探针对细胞脂滴进行高效选择性标记是前提。这就需要明晰荧光探针的分子结构与细胞脂滴标记选择性之间的构效关系。本课题组在这方面开展了较为系统的工作，明确指出与荧光探针适合的亲疏水性是高效选择性标记脂滴的关键，荧光探针的分子尺寸以及细胞膜穿透性对于高效标记脂滴也有一定影响[59]。随后，需进一步考虑提升荧光探针的光稳定性，因为STED超分辨成像所使用的极强损耗激光会对荧光探针造成快速光漂白。最后，在标记选择性和光稳定性的基础上，考虑如何调控荧光探针的光物理性质以最大程度提升STED超分辨成像分辨率。这3个方面的递进研究，有望实现纳米尺度的细胞脂滴荧光成像。
基于此，本课题组研制了一种基于均二苯乙烯骨架的脂滴荧光探针Lipi-DSB（图5，彩图见期刊电子版）[21]。在均二苯乙烯分子骨架的中心苯环两侧双键和分子两端分别引入吸电子的氰基和给电子的胺基，得到了具有大斯托克斯位移和高光稳定性的给受体结构荧光探针Lipi-DSB。氰基的引入有效提升了光稳定性，而胺基的引入则调控了该荧光探针的脂滴染色选择性。鉴于该探针极性敏感的发射特性，通过原位波长扫描的方式测得细胞中脂滴内的极性介于甲苯和二氧六环之间，表明细胞脂滴内亲脂疏水的环境。将荧光探针Lipi-DSB用于STED超分辨成像，在660 nm损耗光（CW-STED）下该探针展现出了较高的损耗效率，饱和强度（Isat）为10.1 MW cm-2，低于STED成像黄金标准荧光探针ATTO 647N的值（（10～20） MW cm-2）[60-62]。这与该探针较大的斯托克斯位移密不可分，因为它可以使发射光谱与损耗激光有较大的重叠，提高了损耗效率。在STED成像模式下，荧光探针Lipi-DSB染色的细胞脂滴随着损耗光功率从0增加到40 MW cm-2，半峰全宽分辨率也从222 nm提高到了58 nm，远低于光学衍射极限（图5（a））。较大的斯托克斯位移使得该探针可以搭配其他具有小斯托克斯位移的荧光探针四甲基罗丹明实现双色STED成像，从而在纳米尺度清晰地观察脂滴与线粒体的相互作用（图5（b））。鉴于该探针优异的光稳定性，将该探针用于动态STED超分辨成像跟踪，能够连续拍摄1 000张STED照片（图5（c））。可见，在同一损耗激光照射下，四甲基罗丹明很快即被光漂白，而Lipi-DSB几乎没有光漂白。通过动态STED成像，首次观测到了纳米尺度新生脂滴的融合过程（图5（d））。
图5 脂滴荧光探针Lipi-DSB的STED超分辨成像。（a）损耗激光功率依赖的分辨率；
（b）与线粒体荧光探针四甲基罗丹明搭配的双色STED成像；
（c）连续1 000帧的STED超分辨成像动态跟踪；
（d）STED超分辨成像动态跟踪纳米尺度新生脂滴的融合过程[21]Fig. 5 STED super-resolution imaging of lipid droplets fluorescent probe Lipi-DSB. (a) STED laser power-dependent resolution; (b) two-color STED imaging of Lipi-DSB paired with mitochondria fluorescent probe tetramethylrhodamine;(c) time-lapse STED super-resolution imaging (1 000 consecutive frames); (d) dynamic tracking of nascent lipid droplet fusion processes at the nanoscale by STED super-resolution imaging[21]
鉴于脂滴荧光探针Lipi-DSB优异的STED超分辨成像性能，本课题组对均二苯乙烯骨架进行了结构优化，通过内嵌砜基吸电子基团来构筑并环结构，合成了具有高光稳定性和大斯托克斯位移的脂滴荧光探针Lipi-BDTO[22]。该探针在660 nm损耗激光下的饱和强度为6.8 MW cm-2，比荧光探针Lipi-DSB的值（10.1 MW·cm-2）还要低，说明了其优异的损耗效率。将该探针用于共聚焦和STED超分辨成像（图6（a），彩图见期刊电子版）。很多共聚焦成像无法观察到的小脂滴在STED成像下可清晰观察到， STED成像分辨率可以达到65 nm。在脂滴动态追踪STED成像中，连续拍摄200张STED照片后仍能保持70%的荧光强度，说明了荧光探针Lipi-BDTO具有很高的光稳定性。因此，将该荧光探针用于细胞脂滴的3D STED成像（图6（b），彩图见期刊电子版），xy平面和z轴方向分辨率分别为90 nm和110 nm，达到了较高的水平。
图6 脂滴荧光探针Lipi-BDTO的共聚焦和STED超分辨成像。（a）共聚焦和STED成像对比；
（b）3D STED成像[22]Fig. 6 Confocal and STED super-resolution imaging of the lipid droplets fluorescent probe Lipi-BDTO. (a) Comparison of confocal and STED imaging; (b) 3D STED imaging[22]
综上所述，用于STED超分辨成像的脂滴荧光探针首先应具有较高的脂滴染色选择性和光稳定性，之后可以进一步通过改变分子结构来调节荧光探针的光物理性质以实现纳米尺度的细胞脂滴荧光成像。例如，可以通过构建给受体结构来增大荧光探针的斯托克斯位移，在增大损耗截面（σ）以提升损耗效率的同时，还能够避免吸收光谱与损耗激光交叉所造成的再激发过程。由式（1）可知，STED超分辨成像的分辨率d与饱和强度Isat密切相关，而Isat又取决于以下公式：
式中，h为普朗克常量，c为光速，σ为损耗截面，τ为探针的荧光寿命，λSTED为损耗光波长。由于h，c和λSTED均为定值，因此可以考虑通过增大σ或τ以降低Isat，从而提高STED成像分辨率。本课题组已经通过增大损耗截面σ的方式成功地提升了STED超分辨成像分辨率，要想在现有研究成果的基础上进一步提升分辨率，可以考虑研制长荧光寿命的新型有机荧光探针。长的荧光寿命一方面能够降低饱和强度Isat，另一方面还能通过时间门控检测方式进一步提升分辨率。
SIM超分辨显微镜是由M. Gustafsson教授于2000年首次提出的[63-64]。其成像原理是通过具有精细条纹图案的光源照射样品，利用条纹形状入射光与物体不同角度之间的混频生成摩尔条纹（图7），从而在低频区域收集到物镜无法分辨的样品复杂结构细节对应的高频信息[65-66]。通过持续改变结构照明的方向以及相位，在成像过程中得到多张具有摩尔条纹的样品照片，分析处理这些照片后即可得到清晰的样品复杂结构图像。与STED成像相比，SIM成像对所使用荧光探针的光物理性质没有特别需求。从成像原理来说，与传统宽场显微镜相比，SIM超分辨显微镜的分辨能力仅能提升一倍，即100 nm左右。
图7 SIM超分辨成像原理[64]Fig. 7 The principle of SIM super-resolution microscope[64]
SIM超分辨显微镜对所使用荧光探针的光物理性质无特别需求，通常用于脂滴共聚焦成像的荧光探针一般也可以用于脂滴的SIM超分辨成像。但为了研究脂滴在细胞内的动态过程，高的光稳定性对于SIM超分辨成像来说十分重要。对于提升荧光探针的光稳定性，如上文所述，可以通过调节荧光探针的分子结构来增强光稳定性。此外，通过使用具有荧光开关特性的荧光探针构建缓冲体系，也是提升光稳定性的有效策略[27-67]。Xu等人研制了一种具有荧光开关特性的细胞脂滴荧光探针LD-FG（图8）[27]，该探针具有氢键敏感特性。在脂滴内部的中性脂质环境下，不存在氢键作用，展现出荧光亮态。在细胞质等极性条件下，由于氢键作用展现出荧光暗态（图9（a）～（b），彩图见期刊电子版）。因此，使用该探针进行脂滴荧光成像，可以在免洗的条件下实现较高的信噪比。培养基以及细胞质中储存的完整荧光探针可以高效替换脂滴中被光漂白的荧光探针，从而通过这种缓冲液策略实现了高的光稳定性。当然，这种高的光稳定性是荧光成像表观上的，不是说荧光探针没有被光漂白。将荧光探针LD-FG用于细胞脂滴SIM超分辨成像，成功地追踪到了多种脂滴动态过程，如脂滴的生长、收缩、快速运动和相互融合等。其中，脂滴融合包括相邻脂滴间的融合（图9（c），彩图见期刊电子版）和不相邻脂滴间的融合（图9（d），彩图见期刊电子版）。这些结果充分说明了缓冲液策略可以有效提高荧光探针表观的光稳定性，为研制新型用于脂滴SIM超分辨成像的荧光探针提供了一种独特的设计思路。
图8 用于脂滴SIM超分辨成像的有机荧光探针Fig. 8 The organic fluorescent probes for SIM super-resolution imaging of lipid droplets
图9 脂滴荧光探针LD-FG的SIM超分辨成像。（a）缓冲策略提升光稳定性；
（b）荧光探针的光开关特性；
（c）相邻脂滴间的融合；
（d）不相邻脂滴间的融合[27]Fig. 9 SIM super-resolution imaging of the lipid droplets fluorescent probe LD-FG. (a) Buffer strategy enables stable imaging of lipid droplets; (b) fluorescence switching property of the fluorescent probe; (c) coalescence between adjacent lipid droplets; (d) coalescence between non-adjacent lipid droplets[27]
除此之外，目前关于有机荧光探针的脂滴SIM超分辨成像的报道仍非常有限。例如，Chen等人研制了一种近红外脂滴荧光探针DTZ-TPADCN[28]（图8）。该探针不仅可以染色细胞质中的脂滴，还可以染色细胞核内的核脂滴（图10（a），彩图见期刊电子版）。与细胞质中脂滴不同的是，核脂滴是由具有代谢活性的内核膜产生，可以调节细胞核内脂质稳态，局部调节信号脂质的可用性，并能够在脂滴和细胞核之间交换蛋白。将该探针用于SIM超分辨成像，在观察细胞质中脂滴的同时，还能追踪内质网应激反应下细胞核内脂滴的形成，并且首次观察到了信号脂质（甘油二酯）可以促进核脂滴的生成。Yang等人研制了一种脂滴荧光探针NIM-3A[29]，该探针具有较高的脂滴染色选择性，适用于活细胞中脂滴的超分辨成像。在SIM超分辨显微镜下，使用该探针染色细胞脂滴后允许在单细胞水平定量测量脂滴的数量和尺寸（图10（b），彩图见期刊电子版），并且该探针还能用于细胞脂滴的动态过程监测。此外，Yang等人还研制了一种基于萘二甲酰亚胺的脂滴荧光探针NIM-7[30]。该探针在染色细胞脂滴的同时，还能染色细胞内的溶酶体。将该探针用于SIM超分辨成像，通过在不同的激发波长下检测不同的荧光通道，可以同时实时地追踪细胞内脂滴和溶酶体的动态过程（图10（c），彩图见期刊电子版）。荧光探针NIM-7允许通过三维成像定量观察细胞中的脂滴和溶酶体，还能用于不同的细胞线以及斑马鱼胚胎中。
图10 有机荧光探针在脂滴SIM超分辨成像中的应用。（a）荧光探针DTZ-TPA-DCN用于染色核脂滴[28]；
（b）荧光探针NIM-3A用于分析细胞内脂滴数量和尺寸[29]；
（c）荧光探针NIM-7用于追踪脂滴和溶酶体的动态过程[30]Fig. 10 Applications of organic fluorescent probes in SIM super-resolution imaging of lipid droplets. (a) Fluorescent probe DTZ-TPA-DCN used for staining nuclear lipid droplets[28]; (b) fluorescent probe NIM-3A used for analyzing the number and size of lipid droplets[29]; (c) fluorescent probe NIM-7 used for tracking dynamic processes of lipid droplets and lysosomes[30]
与共聚焦成像相比，SIM超分辨成像可以提供更高的分辨率，以便更清晰地观察脂滴的空间分布以及追踪脂滴的动态过程。虽然成像分辨率不及STED超分辨显微镜，但SIM超分辨显微镜适用性更广。从理论上讲，大部分的脂滴共聚焦成像荧光探针都能应用于脂滴SIM超分辨成像。而且，SIM超分辨成像技术的进步，如SSIM（饱和结构光照明显微镜）、Hessian-SIM（海森结构光照明显微镜）、GI-SIM（掠入射结构光照明显微镜）、JSFR-SIM（空频重建结构光照明显微镜）等[39-45]，可以进一步提升成像空间时间分辨率。
与STED超分辨成像的点扩散函数抑制和SIM超分辨成像的结构光调制不同，PALM超分辨成像通过单分子定位的原理打破衍射极限的限制从而实现超分辨成像[68]。对于传统的宽场显微成像，样品中每个荧光分子都是同时点亮的，这样会引起每个荧光分子的艾里斑叠加在一起从而无法清晰分辨。当仅有部分相互间距离较大的荧光分子是点亮状态时，它们的艾里斑就可以相互区分开，每个荧光分子的发光中心就能够定位，并且定位精度可以很高。之后再通过对每个荧光分子位置进行叠加处理，就可以重构出分辨率超越衍射极限的荧光照片。这就是单分子定位的成像原理（图11，彩图见期刊电子版）。PALM超分辨显微镜采用的即是该原理，它的成像分辨率d为：
图11 分子定位技术原理示意图[68]Fig. 11 Schematic diagram of molecular localization technology[68]
式中λ为激发波长，NA为显微镜的数值孔径，N指的是每个荧光团包含的光子个数（一般在几百到几千）。因此，PALM超分辨显微镜的空间分辨率可以达到很高（约20 nm）。但与STED和SIM成像技术相比，复杂的数据和图像后处理步骤致使PALM成像速度较慢，时间分辨率不高。根据上述成像原理，PALM超分辨成像对荧光探针的要求就是需要荧光探针在组合激光（激活光和激发光）的照射下能够实现光开关，这样利用荧光探针在荧光亮态和荧光暗态之间随机切换的特性就可以实现单分子定位，进而实现PALM超分辨成像。
在PALM超分辨成像中，最常用的荧光探针是荧光蛋白和有机分子，一个荧光蛋白通常包含几百个光子，而一个有机分子通常包含几千个光子。由式（3）可知，光子数越多实现的分辨率就越高。因此，从分辨率的角度来说，有机分子荧光探针比荧光蛋白更具优势。应用于PALM超分辨成像的有机分子荧光探针为了具有光开关特性，通常需要在分子结构上修饰邻硝基苄醇、苯甲酰甲基和叠氮苯基等基团[69-72]。然而，由于需要使用具有较强光毒性的紫外光激活，严重限制了这些荧光探针在生物体系中的应用。为了解决该问题，Xiao等人提出了一种通过单原子替换实现光开关的通用策略，即将硫代羰基中的硫原子在空气中通过光诱导氧化作用替换成氧原子，从而实现荧光探针从荧光暗态到荧光亮态的转变[31]（图12（a），彩图见期刊电子版）。
图12 光开关荧光探针在脂滴PALM超分辨成像中的应用。（a）具有荧光开关特性的有机荧光探针；
（b）脂肪细胞中脂滴在宽场和PALM显微镜下的明场和双色成像[31]Fig. 12 Applications of light-switchable fluorescent probes in PALM super-resolution imaging of lipid droplets. (a) The organic fluorescent probes with fluorescence ON/OFF characteristics; (b) bright field and two-color imaging of lipid droplets in adipocyte under wide-field and PALM microscopes[31]
利用这种策略得到的荧光探针可以通过可见光激活，避免了紫外光激活造成的光毒性。将荧光探针SNile Red用于宽场、微分干涉（DIC）以及PALM超分辨显微镜，如图12（b）所示，在明场通道下，宽场显微镜不能清晰分辨脂肪细胞中的脂滴，微分干涉显微镜可以分辨出脂滴轮廓，PALM超分辨显微镜在此基础上能给出更多的结构细节，定位精度可达13 nm。搭配另外一种商用染料，还可以实现脂滴的双色PALM超分辨成像。与宽场显微镜下的荧光图像相比，分辨率实现了大幅度提升，荧光图像更加清晰。
Xiao等人还提出了另一种实现荧光探针光开关的策略，即将荧光探针结构中的肟基团通过光脱肟氧化反应转化为其羰基衍生物，从而实现荧光暗态到荧光亮态的转变[32]。通过这种策略得到的荧光探针可以在活细胞共聚焦成像中靶向不同细胞器。在没有细胞毒性添加剂的生理条件下，利用这些探针可以在较低的激活光功率下实现PALM超分辨成像。其中，细胞脂滴的PALM超分辨成像与传统的宽场荧光成像相比，分辨率有显著提升，定位精度可达55.7 nm。Xiao等人提出的上述两种实现荧光探针光开关的策略为细胞脂滴PALM超分辨成像荧光探针的研制提供了独特思路。
除此之外，BODIPY衍生物也可以用于基于单分子定位的超分辨成像。Adhikari等人利用BODIPY衍生物可以在基态瞬时形成二聚体导致发光红移从而实现光开关的特性。通过单分子定位超分辨成像技术，在纳米尺度实现了活细胞中脂滴、脂肪酸和溶酶体的超分辨成像[33]。荧光成像结果说明了在喂养和禁食状态下酵母细胞中脂肪酸和中性脂质不同的空间分布和流动性。这种BODIPY衍生物荧光探针还可以与其他荧光探针联用实现多色荧光成像。
总之，PALM超分辨成像能够实现较高的空间分辨率和定位精度，尤其是使用有机小分子荧光探针时。但复杂的后处理过程使得PALM超分辨成像时间分辨率较低，在实时动态成像方面还有较大的提升空间。PALM超分辨成像的单分子定位原理还可以进一步与STED超分辨成像原理相结合，由此制得的MINFLUX超分辨显微镜能够实现1～3 nm分辨率的细胞结构成像[73]，有望实现超分辨荧光显微镜应用在生物成像领域的终极目标。
2014年，3位物理学家之所以能够获得诺贝尔化学奖，是由于他们采取不同的光学成像方法结合与之相匹配的具有独特荧光性质的化学荧光探针巧妙地绕过了衍射极限，用光学显微镜获得了纳米量级的成像分辨率。这些超分辨成像技术的出现极大地促进了生命科学研究的发展，允许人们从微观层次去寻找生命现象的本质规律。表1总结了几种不同成像方法的细胞脂滴的超分辨成像结果。
表1 文献中报道的细胞脂滴超分辨成像结果总结Tab. 1 Summary of super-resolution imaging of cell lipid droplets reported in the literatures
STED、SIM和PALM技术允许人们在纳米尺度上观察脂滴分布，追踪脂滴的生长、分解、运动和相互融合等动态过程，以及观察脂滴与其它细胞器如线粒体、内质网、溶酶体和细胞核等的相互作用。这些研究极大地促进了脂滴细胞生物学的研究，让人们对脂滴这一细胞器有了更深刻的认识。在这些超分辨成像技术中，STED超分辨成像可以提供较高的空间时间分辨率，但所使用的强损耗激光通常会对荧光探针造成严重的光漂白，因此需要荧光探针具有较高的光稳定性。另外，STED超分辨成像还需要荧光探针在损耗激光波长处具有良好的受激发射损耗特性，且不会被损耗激光直接激发。SIM超分辨成像适用性较广，对荧光探针没有特殊要求，理论上普通荧光成像所使用的荧光探针即可用于SIM超分辨成像。但由于成像原理的限制，成像分辨率相比于传统宽场显微镜只能提升一倍，达到100 nm左右。不过随着SIM超分辨成像技术的不断发展，SSIM、Hessian-SIM、GI-SIM以 及JSFR-SIM等新技术的出现可以进一步提升成像分辨率。PALM超分辨成像通过单分子定位原理，利用具有光开关特性的荧光探针可以实现很高的空间分辨率和定位精度，但复杂的成像后处理过程使得时间分辨率较低，在实时动态成像方面还具有较大的提升空间。为了实现高质量的荧光成像，除了先进的荧光显微镜外，还离不开与之相匹配的光物理性质独特的荧光探针。总体来说，现有用于超分辨成像的脂滴荧光探针非常有限，且成像性能如分辨率、成像帧数等急需进一步提升。STED超分辨成像还面临损耗激光过强导致的高光毒性问题；
另外，还需要研制具有不同波段吸收和发射特性的荧光探针以满足多色成像需求等。通过长时间、高分辨率观测活细胞脂滴，有望解决细胞脂滴生物学的系列关键问题，如脂滴从内质网脱落的过程、脂滴与线粒体之间的相互作用及能量代谢等。希望通过本文关于超分辨成像脂滴荧光探针的介绍与讨论，吸引相关研究者们研制更多的新型荧光探针，早日揭开关于细胞脂滴的众多谜团，促进脂滴细胞生物学走向更深层次的研究。
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