百合AP2/ERF,家族转录因子基因LoERF4,的克隆和生物信息学分析*

王 浩，孙 亮，张济民，贾文杰，吴雅文，张小平，李 想，王有国

(1.云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201；
2.金华职业技术学院 农学院，浙江 金华 321017；
3.云南省农业科学院 花卉研究所，云南 昆明 650205)

百合(Liliumspp.)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本球根植物，是世界上重要的观赏花卉之一。百合品种西伯利亚(Lilium oriental‘Siberia’)属于东方百合杂种系，是百合中的名优品种，由于其花色丰富、气味芳香而深受消费者喜爱，在近几年的国际和国内花卉市场中十分畅销，在切花生产中的地位也越来越重要[1]。然而，百合鳞茎具有休眠的特性，解除休眠的时间太长或休眠解除不彻底会严重影响百合切花质量，造成品质差和产量低等问题，从而严重影响百合切花的经济价值[2]。因此，研究百合鳞茎休眠机理并挖掘与筛选百合休眠相关基因至关重要。

AP2/ERF 转录因子是一种具有多种生物功能的基因家族，它包含1 个有60～70 个氨基酸的保守AP2/ERF DNA 结合区[3]。根据组成AP2/ERF 保守结构域数量和序列的差异，AP2/ERF 基因家族被划分为4 个亚家族，包括AP2、CBF/EREB、RAV和ERF 亚家族[4]。作为AP2/ERF 转录因子家族的成员之一，乙烯响应因子(ethylene response factors，ERFs)拥有1 个典型的AP2/ERF 结构域。根据ERF基因的DNA 结合区和顺式反应单元的特异性，ERF 转录因子的家族成员被分为2 种不同的类别，第1 种可以与GCC-box (AGC-CGCC)结合调控下游基因的表达；
第2 种与DRE/CRT 顺式作用元件结合，在诱导逆境(干旱、盐碱和冷害等)基因表达过程中起重要作用[5]。

ERF 转录因子已被证明在植物生命周期中发挥着多种作用，是若干生物学过程的关键调节者，包括植物发育[6]、植物初级和次级代谢物调节[7]以及生物和非生物胁迫响应[8]等。另有研究指出：ERF 类转录因子还与植物的休眠解除密切相关。如：冯丹等[9]通过克隆从马铃薯(Solanum tuberosumL.)块茎中获得1 个马铃薯ERF5基因，结合实时荧光定量的结果认为该基因在打破马铃薯的块茎休眠以及块茎芽的生长过程中发挥调控作用；
在牡丹(Paeonia sufiuticosaAndr.)花芽的休眠解除过程中，PsERE11基因通过调控相关内源激素的合成对牡丹花芽休眠解除起作用[10]；
JIMENEZ 等[11]研究发现：用乙烯利处理欧洲水青冈(Fagus sylvaticaL.)的种子，或在有限的含水量下通过潮湿的预冷却处理打破休眠时，FsERF1基因的转录水平显著增加，种子的休眠被打破、开始萌发；
王月[12]研究认为：PpCERF1基因在中国樱桃[Prunus pseudocerasus(Lindl.) G.Don]休眠解除过程中起关键作用，PpcERF1可能是通过调控CYP 和JA 类基因表达而发挥促进休眠解除的作用；
此外，还有研究发现桃(Prunus persicaL.)PpeERF3b[13]以及杨树(Populus simoniivar.przewalskii(Maxim.) H.L.Yang]EBB1基因[14]也与种子萌发相关。

目前，通过克隆和实时荧光定量检测技术，ERF 类转录因子在大量物种中得到了研究，如：拟南芥(Arabidopsis thalianaL.)[15]、水稻(Oryza sativaL.)[16]、烟草(Nicotiana tabacumL.)[17]和玉米(Zea maysL.)[18]等，但这些研究重点关注了模式植物，在百合中的研究相对较少。本研究通过转录组测序技术获得了百合品种西伯利亚小鳞茎休眠解除过程中的转录组数据，筛选和克隆参与小鳞茎休眠解除的AP2/ERF 基因LoERF4，并对该基因进行生物信息学分析和表达分析，旨在为探析百合ERF基因对百合鳞茎休眠解除的调节机制研究提供科学依据。

1.1 供试材料

试验所用材料为百合品种西伯利亚的小鳞茎。西伯利亚开花种球于2021 年1 月6 日购自云南沃德园艺有限公司，在28 ℃恒温条件下包埋平均围径(12～14 cm)的中、外层鳞片，培养45 d 繁殖获得小鳞茎。将小鳞茎用湿度为70%的椰糠基质包裹，放置在(4±1) ℃的低温环境中冷藏处理70 d，冷处理结束后取出并将其根部切取1～2 cm，水洗后晾干备用。

1.2 方法

1.2.1 乙烯对百合小鳞茎休眠解除的影响

选择60 个大小一致、鲜质量约为0.4 g 的供试小鳞茎随机分成2 组，每组30 个(含3 次重复)，一组小鳞茎用蒸馏水(CK)浸泡处理2 h，另一组小鳞茎用100 μmol/L 的乙烯溶液处理2 h (该浓度是实验室在前期试验中筛选出的最佳处理浓度)。处理完毕后用吸水纸吸干，将小鳞茎接种到以琼脂作为基质的玻璃瓶中，每瓶接种5 个小鳞茎；
后将其置入恒温箱中 28 ℃黑暗培养30 d，每天观察小鳞茎萌发状态，以小鳞茎培养至长出鳞片叶并突破顶端0.5 cm 即认为萌发，记录各处理组小鳞茎开始萌发的时间；
同时在培养后的0、10、20 和30 d 对小鳞茎进行取样，用液氮迅速冷冻处理后存储在-80 ℃的低温冰箱中，0 和30 d 的材料用于转录组测序。每个样品3 次生物学重复。

1.2.2 百合小鳞茎总RNA 及cDNA 的反转录

采用改良的CTAB 法[19]提取待测百合小鳞茎的总RNA，然后按照iScriptTMgDNA Clear cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书，冰上配制16 μL 去gDNA 体系，25 ℃孵育5 min，75 ℃孵育5 min，去除gDNA。冰上配制20 μL 反转录体系，25 ℃孵育5 min，46 ℃孵育20 min，95 ℃变性1 min，冰上冷却，立即用于qPCR 检测。然后将cDNA置于-20 ℃冰箱内中保存待用。

1.2.3LoERF4基因全长序列克隆

本研究前期的转录组数据由北京百迈客生物科技有限公司通过边合成边测序(sequencing by synthesis，SBS)技术获得，在这些数据中筛选得到LoERF4基因的序列，以cDNA 为模板，在该基因序列两端分别设计带有酶切位点(BsaI 与Eco32 I 双酶切处理)的引物，由武汉伯远生物科技有限公司合成正、反向引物(表1)。经聚合酶链式反应扩增技术扩增PCR，然后克隆LoERF4基因的全长片段。PCR 总反应体系为50 μL，包括cDNA 模版1 μL，正、反向引物各2 μL，dNTP 25 μL，去离子水20 μL。PCR 扩增反应程序为：94 ℃预变性5min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸36 s，30 个循环；
72 ℃延伸10 min，16 ℃保持30 min，停止反应。PCR 扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳在5 v/cm 电压条件下电泳20 min，在紫外灯下切取电泳片段，使用Axygen AxyPrepTMMag PCR 纯化试剂盒进行溶胶回收和纯化，检测无误后将PCR 产物连接至pBWA(V)HS 载体，再转化至感受态细胞top10 上。菌落PCR 筛选阳性克隆，送至武汉伯远生物科技有限公司测序。

1.2.4LoERF4的实时荧光定量PCR 表达分析

以1.2.2 节反转录待用的各处理cDNA 为材料，以Actin基因为内参基因，通过qRT-PCR 分析各处理下LoERF4基因在小鳞茎中的表达情况。参照bimake 生产的2× SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒的操作说明书进行荧光定量PCR 分析，引物序列见表1。qRT-PCR 反应体系为20 μL，包括SYBR Green qPCR Master Mix (2×)10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反应程序为：95 ℃预变性2 min；
95 ℃变性15 s；
60 ℃退火30 s；
72 ℃延伸30 s，40 个循环。溶解曲线制作程序为：95 ℃ 15 s，60 ℃60 s，95 ℃ 15 s。每个样品均设3 个重复。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

采用2-ΔΔCt计算相对表达量；
采用SPSS 软件中的one-way ANOVA 进行方差分析，并用Turkey test 分析不同样品间的显著性；
采用Origin 2018 制图。

1.2.5 生物信息分析

利用ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析基因开放阅读框(open reading frame，ORF)；
利用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行序列比对和同源序列搜索；
利用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 分析蛋白质的物理和化学性质；
利用ProtScale (http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) 分析蛋白质的亲水性和疏水性；
利用TMHMM Server v.2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0) 解析蛋白跨膜区域；
利用SignalP3.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0) 分析蛋白质信号肽；
利用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/) 分析蛋白质的亚细胞定位方式；
利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 分析蛋白质的保守结构域；
利用Expasy (htps://www.expasy.org/) 分析蛋白质的二级结构；
利用 SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/) 分析蛋白质的三维结构。

采用DNAman 软件将LoERF4 氨基酸序列与NCBI 基因数据库中陆地棉(Gossypium hirsutum，XP_016753339.1)、茶树(Camellia sinensis，XP_028108250.1)、葡萄(Vitis vinifera，CBI30599.3)、圆锥南芥(Arabis alpina，KFK31657.1)、猕猴桃(Actinidia deliciosa，ADJ67436.1)、烟草(Nicotiana tabacum，NP_001312182.1)、杂交百合(Liliumhybrid division I，QYI40124.2)和冬瓜(Benincasa hispida，XP_038883348.1)的ERF 氨基酸序列进行比对；
利用MAGA 7.0 中的邻近法(neighbor-joining)对具有高相似度的氨基酸序列进行系统进化树构建，校验参数步长(bootstrap)设置为1 000 次。

2.1 LoERF4 基因克隆及测序结果

以百合品种西伯利亚小鳞茎cDNA 为模板进行PCR 扩增，其产物在500～750 bp 间有1 条清晰的条带(图1)；
切胶回收后的测序结果显示其全长为606 bp，共编码201 个氨基酸(图2)。

图1 LoERF4 的PCR 产物Fig.1 PCR products of LoERF4

图2 LoERF4 基因序列及其编码的氨基酸Fig.2 LoERF4 gene sequence and its encoded amino acid

2.2 LoERF4 基因所编码蛋白的理化性质预测

LoERF4 蛋白氨基酸的区间含有1 个典型的保守AP2 结构域，证实LoERF4 蛋白属于AP2/ERF家族成员蛋白。

ProtParam 分析结果显示：LoERF4 蛋白的相对分子量约为21.52 ku，理论等电点为6.43，分子式为C950H468N268O301S2，共含有2 989 个原子。该蛋白由20 种不同的氨基酸组成，以丙氨酸的含量最高，占总量的12.9%；
胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸的含量最低，分别占总量的0.5%。LoERF4蛋白有24 个带负电荷的残基(Asp+Glu)和23 个带正电荷的残基(Arg+Lys)，不稳定系数为53.72，表明该蛋白属于不稳定蛋白；
脂肪系数为61.79；
总的平均亲水性系数为-0.418。

ProtScale 分析结果(图3)显示：LoERF4 蛋白在氨基酸第86 位分数最低(-2.944)，拥有的亲水性质最强，分数小于0 的位点多位于第5～8、16～49、52～61、66～75、81～112、130～138 和155～172 位；
在第118 位分数最高(1.411)，拥有的疏水性质最强，分数大于0 的位点主要定位在第9～15、76～80、113～129、141～150、175～181、186～190 和192～196 位。因此，推测该蛋白是不稳定的亲水性蛋白。

图3 LoERF4 蛋白的疏水性预测Fig.3 Hydrophobicity prediction of LoERF4 protein

2.3 LoERF4 蛋白跨膜区和亚细胞定位

LoERF4 蛋白不存在跨膜螺旋，其数值为0；
N-末端位于细胞质侧膜的总数为0.005 59。结合图4 可知：全部蛋白质是膜外蛋白质的可能性大于1，而膜内蛋白质和跨膜蛋白的可能性是0，故认为该蛋白质没有跨膜结构。WoLF PSORT 分析结果表明：LoERF4 蛋白可能定位于细胞核上。

图4 LoERF4 蛋白跨膜结构分析Fig.4 Analysis of the tansmembrane structure of LoERF4 protein

2.4 LoERF4 蛋白结构预测

由图5 可知：LoERF4 蛋白包含4 种二级结构，包括40 个氨基酸形成的α-螺旋(占19.90%)、43 条延伸链(占21.39%)、17 个氨基酸形成的β-转角(占8.46%)和101 条随机卷曲(占50.25%)。因此，该蛋白的主要结构为随机卷曲。对Lo-ERF4基因所编码蛋白的三级结构进行预测，结果(图6)显示：其三级结构以无规则卷曲为主，符合二级结构预测结果。

图5 LoERF4 蛋白质的二级结构分析Fig.5 Secondary structure analysis of LoERF4 protein

图6 LoERF4 蛋白质的三级结构分析Fig.6 Tertiary structure prediction of LoERF4 protein

由图7 可知：LoERF4 蛋白存在信号肽的可能性为0.023，位于第18～19 位最可能剪切位点的可能性为0.015。该蛋白质剪切位点分值为0.044，位于第 36 位；
综合剪切位点分值为 0.045，位于第6 位；
信号肽分值为0.332，位于第1 位；
平均信号肽分值为0.268，位于第1～5 位。因此，预测LoERF4 所编码的蛋白为非分泌蛋白，不存在信号肽。

图7 LoERF4 蛋白质的信号肽分析Fig.7 Signal peptide analysis of LoERF4 protein

2.5 LoERF4 蛋白同源性与系统进化树分析

由图8 可知：LoERF4 同参与比对的植物氨基酸序列具有较高的相似性，且都含有1 个AP2/ERF 保守结构域。系统进化树(图9)显示：百合品种西伯利亚与杂交百合在同一分支，表明它们之间的亲缘关系最近。

图8 LoERF4 蛋白与其他植物的同源性比对Fig.8 Homology comparison of LoERF4 protein with other plants

图9 LoERF4 的系统进化树Fig.9 Phylogenetic tree of LoERF4

2.6 小鳞茎不同休眠时期的形态学变化和LoERF4基因表达分析

由图10 可知：乙烯处理组小鳞茎在第20 天表现出萌发特性，萌发出鳞片叶；
而对照组小鳞茎直到第30 天才开始萌发，表明100 μmol/L 乙烯可以有效促进百合品种西伯利亚小鳞茎打破休眠并提前萌发。

图10 不同休眠时期小鳞茎的形态变化Fig.10 Morphological changes of bulblets in different dormancy stages

由图11 可知：乙烯处理后，LoERF4基因的相对表达量总体上呈现下降—上升—下降的趋势，并且在0 d 时极显著高于对照，表明该基因在乙烯处理后，快速响应并表达；
10 d 时，乙烯处理组的表达量低于对照组，表明乙烯可能在小鳞茎休眠解除前期抑制了LoERF4基因的表达；
20 d 时(小鳞茎开始萌发)，乙烯处理组的表达量极显著高于对照组，约为对照组的3.44 倍；
30 d时，对照组和处理组的LoERF4基因均呈现低表达，表明乙烯主要在小鳞茎萌发时起作用。

图11 不同休眠时期小鳞茎的LoERF4 基因相对表达量Fig.11 Relative expression level of LoERF4 gene in different dormancy stages

作为百合科百合属植物，百合在观赏、食用和药用等方面有广泛的应用，探究百合的休眠调控机制对中国百合花卉产业有重要的价值。到目前为止，很少有ERF基因在百合属植物中被克隆，关于该基因对百合休眠解除的影响也未见报道。

本研究从百合品种西伯利亚小鳞茎转录组数据中筛选、克隆得到1 个与小鳞茎休眠解除密切相关的基因LoERF4，并对其进行生物信息学分析和基因表达量分析，结果显示：LoERF4全长606 bp，编码201 个氨基酸，包含1 个典型的AP2保守区域，表明其属于ERF 亚家族转录因子；
其蛋白相对分子量约为21.52 ku，理论等电点为6.43，为亲水性蛋白，无跨膜结构；
通过蛋白质二级结构分析发现：LoERF4 蛋白中无规则卷曲占比最高，而螺旋相对较少，表明该蛋白是不稳定蛋白，符合其三级结构分析结果。

ERF 类转录因子在不同的激素、非生物胁迫以及病原体所引起的信号传导系统中发挥着关键作用[20]，如调节植物对激素、病原和胁迫等的应答反应，从而对植物的生长和逆境进行调控[21]。鉴于ERF 类转录因子是植物响应非生物胁迫的关键调节者，为排除水分等关键非生物胁迫因子对LoERF4表达的影响，课题组前期对小鳞茎进行了琼脂糖培养、基质(无土)栽培和土壤栽培试验，结果表明：在同样处理条件下，琼脂糖培养的百合小鳞茎萌发率相对一致，且在琼脂糖培养条件下利用乙烯溶液浸泡处理小鳞茎后再进行栽培能有效解除西伯利亚小鳞茎的休眠[22]。本研究表明：100 μmol/L 乙烯溶液有助于打破小鳞茎休眠，这与前期研究得到的结果一致。结合基因表达量分析发现：与对照组相比，乙烯处理组百合小鳞茎的LoERF4表达量在处理后的0 和20 d 极显著上调，表明乙烯介导的百合小鳞茎萌发需要LoERF4在早期维持较高的表达水平，暗示Lo-ERF4可能是小鳞茎萌发的重要调节因子。

已有研究证明：ERF基因受各类信号分子的诱导表达并行使相应的功能。对枸杞(Lycium chinenseMiller)的研究发现：乙烯可诱导LchERF基因表达从而增强植株盐胁迫抗性[23]；
对拟南芥的研究也发现：在外源乙烯诱导下，AtERF4基因对乙烯的敏感性下降[24]；
对多花水仙(Narcissus tazettavar.chinensis)[25]休眠的研究也发现：NtERF2和NtERF115可通过响应乙烯参与多花水仙鳞茎的休眠解除过程。这与本研究结果基本一致，但基因表达量的变化趋势有所差异，推测这是由于不同植物对乙烯的敏感性不同以及乙烯处理材料的方法不同所致。此外，有研究发现：ERF 类转录因子可以通过调节下游基因表达实现相应的功能，如：在葡萄(Vitis viniferaL.)芽休眠解除过程中，转录因子VvERF59控制下游基因VvACS1的表达，参与乙烯生成、细胞壁降解、呼吸速率调节和非生物胁迫响应等，最终解除葡萄芽休眠[26]。然而，百合中ERF基因是如何调控下游基因的表达还需进行更深入的研究。

百合鳞茎休眠的形成和解除休眠的调节过程并不是由某一个基因调节引起的，而是由鳞茎各个系统和相应的代谢途径共同决定。在兰州百合[Lilium davidiivar.willmottiae(E.H.Wilson) Raffill]的鳞茎休眠解除过程中发现：维持休眠的内源脱落酸(ABA)含量明显下降，而内源生长素(IAA)和赤霉素(GA3)水平快速上升，导致鳞茎休眠被打破并开始萌发[27]。已有研究也发现：乙烯参与植物种子的休眠和萌发过程，并通过调控脱落酸的代谢以及信号传导途径对脱落酸产生拮抗作用[28]。结合本研究结果和已有研究结论，推测LoERF4的表达量在0 和20 d 极显著高于对照而在10 d 低于对照组的原因可能与小鳞茎内源乙烯或其他植物激素信号变化有关。今后可以结合小鳞茎休眠解除过程中的激素变化研究百合鳞茎休眠解除的分子机制。

本研究在百合品种西伯利亚中成功克隆了LoERF4，该基因属于ERF 亚家族转录因子，是没有跨膜结构的亲水性蛋白。LoERF4的表达量在小鳞茎萌发时极显著上升，表明其参与了小鳞茎休眠解除且受到外源乙烯的诱导，推测LoERF4可能是引起小鳞茎休眠解除并萌发的潜在因子。

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