低氧诱导因子1及其相关调节蛋白研究进展

岳怡明,皇昊,陈中原,卢玲,刘云章

(中国海洋大学医药学院,山东 青岛 266003)

众所周知，氧气是许多生化代谢途径的电子受体，细胞需要持续的氧气供应作为代谢反应的底物。当氧浓度降低时，机体通过激活低氧信号通路来调控一系列生理病理活动。而低氧信号通路中低氧诱导因子(HIF)的发现，则开创了一个全新的研究领域，具有重要的理论价值和巨大的应用潜力。HIF通过调节数百个基因的转录来维持每个细胞中氧的供需平衡，尤其是在肿瘤细胞中，HIF影响肿瘤细胞的代谢、增殖、转移、侵入和凋亡。在研究过程中，如果直接将HIF-1作为靶点进行药物的研发设计，可能会造成药物的副作用，若以相互作用蛋白为研究靶点，对疾病的治疗可能会更加有效。本文对近年来发现的与HIF-1α相互作用的分子及其作用机制进行了总结。

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β这两个亚基组成，每一个亚基都包含基本的helix-loop-helix(bHLH)和Per-ARNT-Sim(PAS)结构域，它们共同介导两个亚基二聚化及其与DNA的结合[1-2]。其中的HIF-1α是可以响应氧气调控的亚基，共编码826个氨基酸，其编码基因定位于人染色体14q21-q24。HIF-1α蛋白N端含有bHLH结构域、PAS-A和PAS-B结构域；
HIF-1α蛋白C端含有氧依赖的降解结构域(ODD)以及NAD(N-terminal activation domain)和CAD(C-terminal activation domain)两个转录激活结构域；
大概576～785位的氨基酸为抑制结构域(ID)，此结构域可以降低HIF-1α蛋白转录激活结构域的活性，特别是在常氧条件下更加明显。HIF-1β是芳基碳氢化合物核转运蛋白(ARNT)，其编码基因定位于人染色体1q21-24，HIF-1β可以和不同的bHLH-PAS蛋白质二聚化，但不能响应氧气的变化[3]。

在正常氧浓度环境中，HIF-1α的半衰期很短，在生物细胞中不停地合成与降解。在低氧条件下，HIF-1α的ODD中有两个特殊的脯氨酸残基(Pro402和Pro564)能够被脯氨酰羟化酶(PHD)识别并羟基化，与肿瘤抑制蛋白(pVHL)结合，pVHL复合体能招募elongin-C/elongin-B/cullin-2 E3泛素蛋白连接酶复合物，进而导致HIF-1α的26S蛋白酶体降解[4]。同样，HIF抑制因子(FIH)是一种2-氧戊二酸和亚铁离子依赖的双加氧酶，它以一种依赖于氧的方式控制HIF的转录活性，也具有羟基化作用。FIH可以通过调节HIF-1α的转录活性来发挥对HIF-1α的调节作用，HIF-1α的天冬酰胺被羟基化后，可阻断转录辅助激活因子CBP/p300与TAD的结合，抑制下游基因的激活。已知公认的经典的低氧信号通路由PHD和FIH共同作用，FIH通过调节氧化，与PHD/pVHL通路协同作用，加速HIF介导的低氧代谢反应[5-6]。然而，随着科学技术的发展和进步，科学家们逐渐发现HIF-1的活性与HIF-1α和其他蛋白之间的相互作用息息相关，这些相互作用的蛋白不断扩充着低氧信号通路[7]。到目前为止，研究已证明有大量蛋白与HIF-1α相互作用。在这些相互作用的蛋白质中，相互作用位点定位于特定的氨基酸残基或HIF-1α的特殊结构域，例如bHLH-PAS结构域(在氨基酸残基1～390位)[1-2]、PAS-B子结构域(在氨基酸残基200～330位)[8]、ODD(在氨基酸残基390～575位)[9]、CAD(在氨基酸残基786～826位)[9]。

HIF-1α具有调节机体氧气运输、血管生成和糖酵解的功能，同时它通过上调涉及肿瘤血管生成、侵袭和转移的基因的表达在肿瘤(乳癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、肾癌等)低氧中发挥重要作用[10]。研究与HIF-1α相互作用的蛋白可以更好地了解疾病发生及其相关信号通路的调控机制，研究人员对相关蛋白功能的了解越精确，就越有可能为更多的疾病提供相应药物以及靶向治疗对策。例如，阿斯利康的新型治疗贫血药物罗沙司他，作为全球首个小分子HIF PHD抑制剂(HIF-PHI)，已于2018年12月率先在中国获批上市。同样都是PHD抑制剂，葛兰素史克的治疗慢性肾病贫血的daprodustat(GSK1278863)也紧随其后，在不同国家和地区提交了上市申请[11]。此外，针对HIF-1α和HIF-2α的特异性抑制剂，也正在进行肾癌等肿瘤适应证的早期临床研究。

3.1 影响HIF-1α氧气依赖的蛋白降解

在HIF-1α氧气依赖的经典降解途径中，一部分与HIF-1α相互作用的蛋白可以通过稳定HIF-1α与其羟基化复合物之间的相互作用或刺激羟基化的HIF-1α泛素化过程，从而实现对HIF-1α的降解调控；
也有一些与HIF-1α相互作用的蛋白通过抑制pVHL-E3泛素连接酶复合体或催化去泛素化来调控HIF-1α依赖于氧气的降解过程[12-19]。这些依赖于O2/PHDs/pVHL途径调控HIF-1α的相互作用蛋白见表1。

表1 依赖O2/PHDs/pVHL途径调控的相互作用蛋白

HICKS等[12]认为，Sprouty同源物2蛋白(SPYR2)充当了HIF-1α和pVHL降解复合物之间的桥梁，从而提高pVHL的局部浓度，促进低氧状态下HIF-1α的泛素化降解。SPYR2对HIF-1α的调节最终转化为对HIF-1α下游靶基因和葡萄糖摄取的调节，因此SPYR2通过调节HIF-1α蛋白水平和基因转录来发挥其抑癌作用，当SPYR2在某些癌症中表达减少或丢失时，HIF-1α的下游靶基因表达升高，从而促进癌症的发生发展。KOZLOVA等[13]研究发现，含SH3结构域的激酶结合蛋白1(CIN85)是PHD2的新型结合伴侣，CIN85的N端结构域与PHD2的N端结构域中的脯氨酸、精氨酸富集区相互作用，可抑制PHD2的活性，从而抑制HIF-1α的降解。泛素C末端水解酶L1(UCHL1)与HIF-1α相互结合可以阻止pVHL与HIF-1α的直接结合，而且低氧可以增强两者的相互作用，两者的结合抑制了pVHL介导的HIF-1α的泛素化[14]。

近年来，随着基因组测序分析技术飞速发展，越来越多的长链非编码RNA(lncRNA)通过基因组大规模的深度测序和转录组分析被鉴定出来。lncRNA在生物生命过程中起着广泛而重要的作用，它们可以通过多种机制以顺式调节或反式调节的方式影响基因的表达。中山大学宋尔卫院士课题组发现了可稳定HIF-1α的lncRNA(HISLA)，HISLA能阻止PHD2与HIF-1α的相互作用，从而抑制HIF-1α的羟基化和降解[20]。有研究结果表明，lncRNA TUG1也可以靶向HIF-1α，其表达减少可以抑制肺腺癌细胞的生长[21]。lncRNA作为潜在的信号转导物，通过囊泡在免疫细胞和肿瘤细胞之间传播，从而促进癌症的有氧糖酵解。

3.2 影响HIF-1α非氧气依赖的蛋白降解

在与HIF-1α相互作用的蛋白中，有一些蛋白对HIF-1α的作用独立于依赖VHL的经典降解途径，这些蛋白对HIF-1α的调控作用不依赖氧气的存在，其作用途径包括增加泛素化及类泛素化修饰、通过蛋白酶体降解的新途径以及分子伴侣介导的自噬(HIF-1α的溶酶体降解)；
在不依赖氧气的情况下，一部分与HIF-1α相互作用的蛋白也可以通过调节泛素化或催化去SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修饰来抑制HIF-1α的降解[22-30]。见表2。

表2 通过非氧气依赖途径调控的相互作用蛋白

基本螺旋-环-螺旋家族成员E41(BHLHE41)最早是由MONTAGNER等[24]发现的一种独立于HIF-1α的pVHL泛素化降解途径之外的蛋白，它可以促进HIF-1α与蛋白酶体的结合，从而导致HIF-1α蛋白酶体降解。同样重要的蛋白还有热休克蛋白70羧基末端反应蛋白(CHIP)，该蛋白作为E3泛素连接酶，在介导蛋白酶体或溶酶体系统底物降解的分类决定中起着关键作用。LUO等[31]研究认为，HIF-1α可以与热休克蛋白70(HSP70)相互作用，并且通过募集E3泛素连接酶CHIP促进了在长时间低氧时HIF-1α的降解，这就是CHIP介导的蛋白酶体降解途径。CHIP同时可以参与HIF-1α溶酶体降解途径，FERREIRA等[26]最早研究发现HIF-1α可以进行伴侣蛋白介导的自噬降解。

3.3 影响HIF-1α的转录活性

另一大组与HIF-1α相互作用的蛋白可以作为共激活物或共抑制物来调节由HIF-1α介导的转录过程，同时，许多与HIF-1α相互作用的蛋白通过促进或抑制HIF-1α与其他蛋白的相互作用来调节HIF-1α的活性，这些与HIF-1α相互作用的蛋白具有催化活性，如乙酰化、去乙酰化、去甲基化、磷酸化或泛素化，导致HIF-1α翻译后修饰，从而影响HIF-1α的稳定性、亚细胞定位或转录激活功能[32-40]。见表3。

表3 调节HIF-1α转录激活的相互作用蛋白

LEE等[32]认为，在低氧条件下，Akt信号通路被激活，诱导糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的第9位丝氨酸残基磷酸化，GSK3β沉默导致货物接头蛋白1(BICD1)和HIF-1α之间的相互作用，HIF-1α被诱导入核，发挥对其下游靶基因的转录调控作用。甲基转移酶G9a是Suv39h蛋白家族的一个重要成员。在哺乳动物中发现的甲基转移酶中，G9a和GLP是组蛋白H3(H3K9me1和H3K9me2)的Lys 9位点单、二甲基化的主要酶，主要以G9a-GLP异聚体复合物的形式存在。近年来，许多重要研究认为G9a和GLP在各种生物过程中起着关键作用，它们介导表观遗传基因调控的生理相关性功能。BAO等[36]研究发现，G9a-GLP与HIF-1α相互作用并在体外和体内直接催化HIF-1α的K674的单甲基化或二甲基化。G9a-GLP介导的K674甲基化可降低HIF-1α的转录活性和多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞中HIF-1α下游靶基因的表达，抑制GBM细胞的迁移能力。在表观遗传调控方面，CHEN等[38]的研究结果证实，溴区结合蛋白(ZMYND8)可以与HIF-1α和HIF-2α相互作用，通过增加BRD4的募集和释放暂停的RNA聚合酶Ⅱ增加HIF下游癌症基因的表达。

HIF-1α在多种疾病中发挥了关键的作用，包括肿瘤、脑缺血、肺动脉高压、糖尿病等，尤其在肿瘤的发生及发展过程中至关重要，其活性的增加促进了肿瘤血管生成相关基因、代谢相关基因的表达，同时也为癌细胞对低氧的其他适应提供了分子基础[41]。

肾细胞癌(RCC)是一种常见的恶性肿瘤，全球肾癌每年导致大于10 0000人死亡。肾透明细胞癌(ccRCC)与pVHL息息相关，ccRCC一般都存在两个pVHL等位基因失活，导致pVHL对HIF的降解功能丧失。在VHL缺陷的RCC异种移植物中重新表达pVHL会减缓肿瘤的生长，证实VHL是真正的肿瘤抑制基因。迄今为止，pVHL最具特征的靶标是HIF的α亚基。pVHL功能的丧失导致HIF-1α的稳定，因此RCC中pVHL的丧失与HIF的激活及其转录激活紧密相关[42]。有研究者使用不同的基因组平台调查了400多例肾癌肿瘤样本，结果显示PI3K/Akt信号通路突变率很高，表明该途径是潜在的治疗靶点[43]。染色质修饰基因在ccRCC中高频的突变为核小体动力学模型的建立提供了强有力的证据，该模型在肾癌发生中发挥了关键作用。尽管有关这种调节如何促进肾癌细胞形成的具体机制尚待确定，但已有的数据揭示了与SETD2基因突变相关的DNA甲基化的改变[44]。作为可以有效改变许多转录输出的表观遗传过程，这些突变可能通过改变整体基因和遗传元件的表达来改变肿瘤的基因组。PI3K/Akt途径是ccRCC未来的一个治疗靶点，像哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路或相关途径抑制剂对ccRCC的治疗具有潜在价值[43]。

乳癌是近几年研究较多的癌症类型，特别是三阴性乳癌(TNBC，侵袭性最强的乳癌类型之一)在全球范围内发病率呈上升趋势，病死率不断上升。众多研究发现，HIF-1α在乳癌细胞中呈现高表达并且与乳癌的发生发展有关[45]。有研究阐明了BHLHE41和HIF-1α之间的相互作用机制，这就为其临床应用奠定了基础，并且已经在TNBC中得到验证。在乳癌细胞中，ZMYND8通过增加BRD4的募集和释放暂停的RNA聚合酶Ⅱ增加了HIF下游癌症基因的表达，在这个过程中，ZMYND8对p300的1 007和1 034位赖氨酸的乙酰化促进了乳癌的生长和转移，这为诊治乳癌提供了可能的分子靶标[38]。有研究表明，表皮生长因子受体(EGFR)衔接子蛋白CIN85可以促进乳癌恶化和HIF的稳定性，这项研究使以前无法识别的肿瘤生长检查点得以发现，该检查点受CIN85-PHD2调控，并将生长因子受体与低氧信号通路联系起来，对肿瘤的生存至关重要[13]。UCHL1在临床中可以促进癌症的转移，与乳癌和肺癌病人的不良预后密切相关，未来也可用作癌症的预后标志物和治疗靶标[14]。

胃癌是全球癌症相关死亡的第3大原因，东亚地区的发病率极高，一旦发现多数被诊断为晚期[46]。因此，研究胃癌的致病机制并寻找有效的肿瘤标志物以提高早期诊断率成为了重中之重。CHEN等[47]的研究表明，lncRNA HIF1A-AS2的高表达与胃癌的不良预后显著相关，HIF1A-AS2敲降可抑制胃癌细胞的体外增殖能力，所以HIF1A-AS2在胃癌的早期诊断中可作为潜在诊断标志物。

HIF-1是转录因子家族的一个重要成员，在调节机体氧的稳态、生物体生理及病理过程中发挥重要作用。在低氧肿瘤细胞尤其是实体瘤中HIF-1存在着过度表达，并控制下游上百种基因的表达，包括葡萄糖转移酶-1(GLUT-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、酪氨酸激酶(c-Met)等，影响肿瘤细胞的代谢、增殖、转移、侵入和凋亡。许多与HIF-1α相互作用的蛋白是HIF-1靶基因的产物，参与前馈或反馈回路，从而放大或消除细胞对低氧的反应。未来对HIF-1α调节因子的研究仍然是热点，探究与HIF相关的基因和结合蛋白有望为临床以及药物研究提供新的方向和机遇。

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