circ_0091581靶向miR-136对皮肤鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响

周 钰，黎晓红，袁雪萍，段亚菊，汤舒玲，罗 咏，王 简

类皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)恶性程度高，肿瘤细胞增殖、转移等与CSCC发生及发展密切相关，分子靶向治疗成为治疗CSCC的潜在治疗方式[1-2]。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类单链非编码RNA，在肿瘤发生和发展中起关键作用[3]。据报道，circRNA在CSCC中表达异常，并可能作为CSCC治疗的潜在靶点[4]。circ_0091581是一种在肝细胞癌中高表达的circRNA，对肝细胞癌细胞增殖及转移有促进作用，并可抑制细胞凋亡[5]。但circ_0091581与CSCC相关研究报道相对较少。Circular RNA Interactome预测显示circ_0091581与miR-136存在结合位点。研究表明miR-136-5p在CSCC中表达下调[6]。因此，本研究主要探讨circ_0091581是否可通过靶向调控miR-136而调节CSCC细胞生物学行为。

1.1 一般资料

1.1.1 临床资料收集2019年10月至2020年2月本院收治的39份CSCC患者的癌组织及癌旁组织标本，保存于-80℃冰箱。所有标本均经病理诊断确诊为CSCC。

1.1.2试剂人CSCC细胞SCL-1购自美国ATCC；
反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化；
si-NC、si-circ_0091581、miR-136 mimics、miR-NC、anti-miR-136、anti-miR-NC购自广州锐博生物；
甲基噻唑基四唑(MTT)、细胞凋亡检测试剂盒、Transwell小室购自北京Solarbio。

1.2方法

1.2.1 实验分组于6孔板接种1×105个SCL-1细胞。参照美国Thermo Fisher公司的Lipofectamine2000说明书，将si-NC、si-circ_0091581、miR-NC、miR-136 mimics、si-circ_0091581与anti-miR-NC(共转染)、si-circ_0091581与anti-miR-136(共转染)分别转染至融合至70%的SCL-1细胞，分别记为si-NC组、si-circ_0091581组、miR-NC组、miR-136组、si-circ_0091581+anti-miR-NC组、si-circ_0091581+anti-miR-136组。

1.2.2qRT-PCR检测基因的表达水平CSCC组织、癌旁组织与各组SCL-1细胞的总RNA通过Trizol试剂提取，反转录合成cDNA，通过SYBR Green试剂盒行PCR扩增反应检测circ_0091581、miR-136相对表达量。

1.2.3甲基噻唑基四唑(MTT)检测细胞增殖于96孔板中接种各组SCL-1细胞(3×103个)，用MTT溶液(20 μL/孔)与SCL-1细胞反应4 h，以DMSO(150 μL/孔)振荡孵育5 min终止反应，应用酶标仪读取SCL-1细胞吸光度(A)值，波长490 nm。

1.2.4平板克隆形成实验各组SCL-1细胞接种于6孔板(500个/孔)，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养14 d弃培养基，预冷PBS洗涤，500 μL甲醇固定SCL-1细胞20 min，400 μL 1%结晶紫染色液染色SCL-1细胞15 min，观察克隆形成数。

1.2.5Transwell实验检测细胞迁移取各组SCL-1细胞接种于上室(1×105个/孔)，将600 μL含10%胎牛血清的培养液加至下室，于37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养48 h，迁移的细胞固定后用1%结晶紫染色，10 min后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，于显微镜下统计穿膜细胞数。

1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡率收集各组SCL-1细胞参照细胞凋亡检测试剂盒的说明，重悬于500 μL结合缓冲液，之后与Annexin V-FITC和PI暗室反应10 min，于FACS Calibur流式细胞仪分析凋亡率。

1.2.7双荧光素酶报告实验检测circ_0091581与miR-136的靶向关系用Lipofectamine2000在SCL-1细胞中共转染WT-circ_0091581与miR-NC或miR-136 mimics、以及共转染MUT-circ_0091581与miR-NC或miR-136 mimics。转染48 h后双荧光素酶活性检测系统测量SCL-1细胞的荧光素酶活性。

2.1 circ_0091581和miR-136在CSCC组织中的表达circ_0091581在CSCC组织中的表达量(2.45±0.37)较癌旁组织(0.93±0.16)增多(P<0.05)，miR-136在CSCC组织中表达量(0.43±0.06)较癌旁组织(0.99±0.11)降低(P<0.05)。

2.2下调circ_0091581对SCL-1增殖、凋亡、迁移的影响与si-NC组比较，si-circ_0091581组miR-136的表达量和细胞增殖抑制率升高(P<0.05)，circ_0091581表达量、克隆形成数和迁移细胞数均降低(P<0.05)，细胞凋亡率升高(P<0.05)，见图1，表1。

a：下调circ_0091581处理后SCL-1凋亡的检测；
b：下调circ_0091581处理后SCL-1迁移的检测

表 1 下调circ_0091581抑制SCL-1增殖、迁移及诱导凋亡

2.3circ_0091581和miR-136靶向关系circ_0091581与miR-136存在结合位点，见图2。双荧光素酶结果显示，与miR-NC和WT-circ_0091581共转染细胞的荧光素酶活性(1.02±0.11)相比，miR-136和WT-circ_0091581共转染细胞的荧光素酶活性(0.38±0.03)显著降低(P<0.05)；
与miR-NC和MUT-circ_0091581共转染细胞的荧光素酶活性相比，miR-136和MUT-circ_0091581共转染细胞的荧光素酶活性(0.98±0.08)差异无统计学意义(P>0.05)。表明circ_0091581可靶向结合miR-136。

2.4miR-136对SCL-1增殖、凋亡、迁移的影响miR-136组细胞增殖抑制率高于miR-NC组(P<0.05)，克隆形成数和迁移细胞数少于miR-NC组(P<0.05)，细胞凋亡率高于miR-NC组(P<0.05)，见图3，表2。

2.5抑制miR-136对下调circ_0091581处理的SCL-1增殖、凋亡、迁移的影响si-circ_0091581+anti-miR-136组细胞增殖抑制率比si-circ_0091581+anti-miR-NC组降低(P<0.05)，克隆形成数和迁移数比si-circ_0091581+anti-miR-NC组增多(P<0.05)，细胞凋亡率比si-circ_0091581+anti-miR-NC组降低(P<0.05)，见图4，表3。

图 2 circ_0091581和miR-136的互补序列

a：miR-1361处理后SCL-1凋亡的检测；
b：miR-136处理后SCL-1迁移的检测

表 2 miR-136抑制SCL-1增殖、迁移及诱导凋亡

表 3 抑制miR-136可逆转下调circ_0091581对SCL-1增殖、凋亡、迁移的作用

circRNA通过与miRNA结合而抑制靶基因表达发挥作用[7]，并参与CSCC发生及发展过程，还可能作为CSCC诊断的潜在生物学标记物及治疗的潜在靶点[8-11]。

circ_0091581在胶质瘤[12]、肝细胞癌[13]中表达上调，下调其表达可抑制细胞增殖、迁移及侵袭。本研究数据表明，circ_0091581在CSCC组织中高表达，暗示circ_0091581在CSCC发生及发展过程中可能发挥癌基因作用。本研究随后利用si-circ_0091581干扰其在CSCC细胞中的表达，发现干扰circ_0091581后，CSCC细胞增殖、克隆形成及迁移被抑制减弱，细胞凋亡被促进。

本研究初步证实circ_0091581可吸附miR-136，并可充当miR-136的海绵分子。研究表明miR-136在黑素瘤[14]、乳腺癌[15]、子宫内膜癌[16]、胃癌[17]中表达水平降低，上调其表达可减弱细胞增殖、迁移及侵袭能力。本研究结果显示，干扰circ_0091581表达可促进miR-136表达，circ_0091581可通过靶向调控miR-136的表达而促进CSCC细胞增殖及转移进而参与CSCC发生及发展过程。

综上所述，CSCC组织中circ_0091581表达上调，miR-136表达下调，circ_0091581可通过充当miR-136的海绵分子而调节CSCC细胞生物学行为，包括细胞增殖、克隆形成、迁移及凋亡，还可为CSCC的治疗提供潜在靶点。但circ_0091581是否可通过靶向调控其他miRNA而参与CSCC发生及发展过程尚需进一步探究。

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