Bcl-xl基因与颅内感染伴癫痫发作的关系研究

陈镇，黄兴刚，杨帝琼

颅内感染是常见的中枢神经系统疾病之一，也是症状性癫痫重要的原因之一，因病原体不同，可分为病毒性感染、结核性细菌感染及化脓性细菌感染等。颅内感染伴癫痫发作患者可表现为急性症状性癫痫发作、脑炎后癫痫及后期无诱因癫痫发作等[1-3]。其中急性症状性癫痫发作通常出现在急性期 (0～7 d内)[4]。其可能的发病机制为致病微生物(特别是嗜神经病毒)可通过血脑屏障或轴突运输侵入中枢神经系统，并在感染过程中诱导神经元细胞水肿、坏死甚至凋亡损伤，同时产生促炎因子，以此激活先天免疫系统，也可激活适应性免疫系统[5]。有研究显示，炎症细胞因子的释放可导致血脑屏障破坏，使有害物质进入颅内导致脑水肿，从而使皮层异常放电，最终引发癫痫[6-7]。也有研究认为，发热、细菌毒素的释放及神经化学物质的变化也可能是导致颅内感染患者出现急性症状性癫痫的原因。

中枢神经系统感染相关的炎症反应与细胞凋亡有密切的关系。有研究证实新生隐球菌感染可以诱导小胶质细胞凋亡及通过线粒体途径诱导宿主细胞凋亡[8]，但这只是细胞和动物基础实验研究，针对颅内感染伴癫痫发作患者发病过程中是否存在凋亡机制的发生，目前尚无相关的临床基础研究。本研究选取2019年10月至2020年10月在遵义医科大学第三附属医院住院治疗的颅内感染伴癫痫发作患者为观察组，不伴癫痫发作患者为对照组，以脑脊液为样本，通过检测Bcl-xlmRNA在两组的表达差异，探讨Bcl-xl基因与颅内感染伴癫痫发作的关系。现将结果报道如下。

1.1 主要试剂与仪器

主要试剂:甲醇(中国天津市富宇精细化工有限公司 )、无水乙醇( 中国重庆市川东化工有限公司)、丙酮 (中国成都金山化学试剂有限公司)、TRIzol Reagent及2×SYBR Green PCR Mastermix。主要仪器为实时荧光定量PCR仪(伯乐型号为 CFX96)、核酸定量仪(Thermo型号为Nanodrop Lite)、匀浆机及逆转录PCR仪等。

1.2 入选标准及排除标准

选取2019年10月至2020年10月在遵义医科大学第三附属医院神经内科住院治疗并诊断为颅内感染疾病的患者36例。入选标准：(1)符合颅内感染诊断标准；
(2)存在癫痫发作的患者符合《临床诊疗指南·癫痫病分册》中的诊断标准。排除标准：(1)存在精神类和神经退行性病变疾病的患者；
(2)存在肿瘤特别是神经系统肿瘤的患者；
(3)合并高血压病、糖尿病及冠心病的慢性病患者。入组患者根据是否有癫痫发作分为有癫痫发作的患者15例为观察组，无癫痫发作的患者21例为对照组。

1.3 方法

1.3.1 提取脑脊液

入组患者在入院第1天行腰椎穿刺后，留取2 mL脑脊液储存于冻存管中置于-80 ℃冰箱储存以备检测。

1.3.2 荧光定量 PCR法检测Bcl-xl的mRNA 基因的表达

引物的设计与合成:根据Gene Bank human BCL-xl及内参GADPH 基因的全序列，用Primer 5.0软件进行设计，序列详见表1。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司进行引物合成。引物合成好后用DEPC水稀释100倍保存于-20 ℃冰箱备用。

表1 设计的引物序列

总RNA 的提取和 CDNA 的合成:将储存于-80°冰箱的脑脊液置于室温，按RNA提取试剂RNA iso Plus说明书提取总RNA;取2 μL RNA在Thermo Nanodrop Lite核酸定量仪测定RNA的浓度和纯度，其中对照组的纯度为(1.83±0.75)，观察组的纯度为(1.89±0.11)。CDNA 的合成参照逆转录试剂盒说明书进行操作，反应体系为20μL，反应完成后于-20 ℃冰箱保存备用。

RT- PCR 反应:在伯乐CFX96实时荧光定量 PCR仪进行以下RT-PCR 反应(步骤为预变性 95 ℃ 3 min，扩增 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；

熔解曲线为95 ℃ 5 s， 60 ℃ 1 min; 冷却为40 ℃ 30 s)。具体反应体系按照说明书操作。经过系统自动提取2-ΔΔCt值。

1.4 统计学方法

2.1 临床基线资料

观察组15例中男性7例、女性8例，年龄14～53岁、平均(26.67±12.09)岁，诊断为病毒性脑炎或脑膜脑炎15例。首发症状：9例为全面强直阵挛发作(60%)，1例为发作性行为异常(7%)，5例为头昏头痛(33%)。伴随症状：以头昏头痛为首发症状的5例患者中4例伴发作性意识障碍，伴发作性右侧面部及右侧肢体抽搐，1例以发作性行为异常为首发症状伴行走不稳，其余无明显伴随症状。诱发因素：7例伴上呼吸道感染，8例无明显诱发因素。对照组21例中男性5例、女性16例，年龄14～67岁、平均(31.67±16.34)岁，其中诊断为病毒性脑炎或脑膜脑炎19例，结核性脑膜炎2例。首发症状：19例为头昏头痛(90%)，1例为精神行为异常(5%)，1例为眩晕(5%)。伴随症状：8例伴发热，1例伴耳后皮肤疱疹，其余无明显伴随症状。诱发因素：21例中有11例存在呼吸道感染，1例为右耳后皮肤疱疹。结果详见表2。

表2 观察组与对照组患者的基线资料比较

2.2 脑电图

观察组15例患者中脑电图异常6例，其中5例为轻度异常，1例为中度异常，异常脑电图均发现有痫样放电，余9例患者脑电图均正常。对照组21例患者中脑电图异常8例，其中3例为轻度异常，4例为中度异常，1例为中至重度异常，余13例患者脑电图均正常。结果详见表3。

表3 观察组与对照组患者的脑电图结果比较

2.3 脑脊液、血常规及影像学

2.3.1 脑脊液

观察组15例患者中4例腰穿脑压>180 mmH2O，范围为(180～240)mmH2O，余11例患者腰穿脑压均在正常范围；
3例患者的腰穿脑脊液常规提示总细胞数异常，以白细胞数增高为主，范围为(10～70)×10-6/L，余均正常；
生化结果均正常。所有患者均未做细菌学检查。

对照组21例患者中4例腰穿脑压>180 mmH2O，范围为(185～255)mmH2O，1例腰穿脑压为75 mmH2O，余16例患者腰穿脑压均在正常范围；
11例存在白细胞数异常，范围为(8～220)×10-6/L，余均正常；
6例患者的生化结果提示蛋白有不同程度的增高，范围为(0.46～2.75)g/L，余15例患者脑脊液蛋白均正常；
2例患者的生化结果提示糖下降，范围为(1.7～2.0)mmol/L，氯下降，范围为(112.0～113.6)mmol/L，腺苷脱氨酶(ADA)升高，范围为(3.7～9.0)U/L，均为结核性脑膜炎患者，余糖氯均正常；
4例患者的脑脊液细菌学检查为阴性，其余未做(表4)。观察组与对照组患者的头颅影像学结果(头颅CT或头颅MRI)均未见脑炎或脑膜炎征象。

2.3.2 血常规

观察组15例患者中7例血常规提示炎性改变，白细胞数范围为(11.2～14.8)×10-9/L，中性粒细胞比率范围为(71.7～86.5)%，余8例均正常。对照组21例患者中6例提示炎性改变，白细胞数范围为(10.9～13.6)×10-9/L，中性粒细胞比率范围为(79.6～89.6)%，余15例均正常。结果详见表4。

表4 观察组与对照组患者的脑脊液及血常规检测结果比较

2.4 脑脊液Bcl-xl mRNA的表达情况

荧光PCR结果显示，对照组患者Bcl-xlmRNA的的表达量为(0.80±0.12)，观察组患者Bcl-xlmRNA的表达量为(0.28±0.09)。观察组mRNA表达量较对照组表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1。

注：*为与对照组比较,P<0.05。

癫痫是一种由于大脑细胞异常过度放电而引起的一过性、反复发作的临床综合征，具有发作性、短暂性、重复性及刻板性的特点。而癫痫发作是指大脑神经元异常和过度的超同步化放电所造成的临床现象。癫痫的发病机制非常复杂，至今尚未能完全了解其全部机制，但发病的一些重要环节已被探知，如痫样放电的起始、传播及终止等。有研究报道，癫痫的发病机制与神经元、通道及基因甚至神经网络结构功能失衡等多因素有关[9-10]。Choi等[11]研究认为脑部的炎症反应也是导致癫痫形成和发作的一个重要机制，因此免疫炎症反应机制与癫痫的关系也越来越受到关注。本文研究对象为颅内感染患者，通过对伴有癫痫发作和非癫痫发作的患者之间进行基线资料和辅助检查结果比较，以及脑脊液中Bcl-xl抗凋亡因子的对比，探讨在颅内感染伴癫痫发作的患者中是否存在凋亡机制的参与。

本研究基于病毒性脑膜炎、病毒性脑炎及结核性脑膜炎的诊断标准，以及2015年中国抗癫痫协会发布的《临床诊疗指南.癫痫病分册》，纳入标准为颅内感染，伴癫痫发作的患者为观察组，不伴癫痫发作的患者为对照组，其中癫痫发作可为惊厥性发作或非惊厥性发作。本研究患者在入院后第1天抽取脑脊液，运用RT-PCR技术探究两组样本中Bcl-xlmRNA的表达情况，探讨Bcl-xl与颅内感染伴癫痫发作的关系。

本研究观察组中男性7例，平均年龄为(28.62±14.79)岁；
女性8例，平均年龄为(23.50±9.07)岁。对照组中男性5例，平均年龄为(37.40±25.26)岁；
女性16例，平均年龄为(29.88±13.09)岁，两组年龄分布比较差异无统计学意义(P=0.32)。观察组中首发症状为全面强直阵挛发作的患者比例为60%，头昏头痛患者的比例为33%，发作性行为异常患者的比例为7%，其中全面强直阵挛发作形式是临床上较容易识别的症状，但针对头昏头痛的患者，本研究中伴随有发作性症状，占比相对较少；
对照组中首发症状为头昏头痛的患者比例为90%，这部分患者需结合详细的病史、脑电图及腰椎穿刺结果来确诊。

有研究结果表明，使用细辛醚干预的KA癫痫大鼠，其海马区促凋亡蛋白因子(Bax)基因的表达量明显高于对照组，而抗凋亡蛋白因子(Bcl-2)基因的表达量明显低于对照组大鼠[12]。曲珍珍等[13]的研究亦显示子鼠怀孕期间痫性发作可使其海马区Bax的表达量增加，而Bcl-2的表达量降低，凋亡执行蛋白(caspase-3)的表达量增加，因此推断子鼠怀孕期间痫性发作可促使海马神经元凋亡。有研究报道，癫痫患者神经元内的抗凋亡因子和促凋亡因子的表达是异常的[14-15]。

有研究表明，在中枢神经系统中，无论是病毒的直接作用或间接作用，均会刺激神经胶质细胞大量分泌细胞因子(如TNF-α、IL-6及IL-10等)，进而产生细胞因子的聚集和级联反应,从而诱导神经元凋亡，最终破坏血脑屏障[16-17]。在小鼠新型隐球菌感染模型中发现,隐球菌可以诱导小胶质细胞的凋亡及通过线粒体途径诱导宿主细胞的凋亡[8]。

综上所述，癫痫的发生有凋亡家族的参与已得到证实，同时颅内感染的发生亦存在凋亡机制的参与，而颅内感染伴癫痫发作的发病机制中是否存在凋亡机制的参与，李志民等[18]以氯化锂修饰颅内感染后癫痫发作为模型，对大鼠海马组织进行免疫组化分析发现，颅内感染的大鼠海马组织中GSK-3β的蛋白表达量显著升高，说明氯化锂修饰颅内感染后癫痫发作的分子机制中有GSK-3β的参与，GSK-3β可以影响细胞色素C的释放及线粒体渗透性，从而参与细胞凋亡的调控。针对颅内感染伴癫痫发作的发病机制中是否存在凋亡机制的参与，目前缺乏对脑脊液方面的研究，特别是对Bcl-xl促凋亡分子或Bcl-2家族的研究。本文的研究对象为病毒性脑炎(包括脑膜炎和脑膜脑炎)及结核性脑膜炎的患者，观察组患者脑脊液中的Bcl-xlmRNA表达量低于对照组，这在一定程度上说明颅内感染伴癫痫发作的发病机制可能与抗凋亡因子Bcl-xl相关。但其中具体的关系目前尚不清楚，是颅内感染导致凋亡发生间接影响癫痫发作，还是颅内感染本身影响癫痫发作，抑或其中是否存在其他因素的参与，需要更多的动物模型或细胞基础实验研究以进一步证实。

颅内感染伴癫痫发作可能存在Bcl-xl促凋亡分子的参与，这对颅内感染伴癫痫发作的可能发病机制和治疗新靶点的研究有了新的方向。

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