基于CK抑制剂虚拟筛选的补骨脂盐炙工艺研究

范冰冰，韩宇，仲人中，郭晏华，马壮

(1.锦州医科大学，辽宁 锦州 121000；
2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳110847)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是多因素所致的以骨含量降低、骨组织的微细构型被破坏为特质，引发骨折、呼吸困难等病症的一种慢性骨质病症[1-7]。补骨脂为豆科植物Psoralea corilyfolia L.的干燥成熟果实，以补肾助阳、固精缩尿为主要功效[8]。传统医学普遍认为肾藏于精，精足生髓，髓隐于骨中，充溢骨骼。因此，补骨脂通过补肾助阳发挥补肾壮骨的作用，在预防和治疗骨质疏松方面具有一定的优势。补骨脂作为抗骨质疏松症(OP)的惯用中药材，需炮制入药，其盐炙法始于宋·《局方》，现代盐炙法为《中国药典》所收录。盐炙走肾，经盐炮制过的补骨脂可增强补肾纳气作用[9-11]，在抗OP方面有独特的优势和开发的潜能。

研究表明，长期性服用借助于促进新生骨质恢复骨量的中药有增加骨吸收的风险，而CK是最早被发现位于破骨细胞中涉及骨质再吸收的主要酶，被很多学者作为抗OP研究的热门靶向蛋白酶。CK[12]存在诱发OP的潜在可能性，其蛋白及mRNA的表达水平抑制被证实能够治疗骨质疏松症[13-14]。补骨脂化学成分复杂，药理作用广泛，因而本研究借助蛋白质结构虚拟筛选技术[15-16]，将CK作为预防和治疗OP的关键靶点，得到补骨脂中抑制破骨细胞活性的成分。以筛选出的成分含量为评分指标，选用星点设计-效应面法甄选补骨脂盐炙工艺技术，实现补骨脂盐炙后有效抑制CK而发挥抗OP目的，为补骨脂盐炙生产工艺的下一阶段研究提供理论支撑。

1.1 仪器与软件

操作软件UCSF Chimera(http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)；
对接软件UCSF DOCK6.0(http://dock.compbio.ucsf.edu/DOCK_6/index.htm)；
戴尔4核计算机(美国戴尔科技有限公司)；
ISIS-Draw软件Open Bable(http://openbabel.sourceforge.net)。

高效液相色谱仪(日本岛津LC-10AT)；
紫外检测器(SPD-10AVP)；
紫外-可见分光光度计(UVmini-1240)；
电子分析天平(Sartorius CP225D)；
超声清洗器(KQ2200型)。

1.2 试药

补骨脂素(四川维克奇生物制剂有限公司，批号：wkq14022602)；
补骨脂甲素(四川维克奇生物制剂有限公司，批号：wkq14080805)；
补骨脂生用品，购于安徽省亳州中药材市场(辽宁中医药大学中药鉴定教研组翟延君教授鉴别为正品药材)；
食用盐(辽宁盐局总厂)；
黄酒(绍兴水乡黄酒酿制有限责任公司)；
娃哈哈纯净水；
乙腈、甲醇(色谱纯，科密欧有限公司)，其它化学试剂(分析纯)。

2.1 虚拟筛选

本研究采用实验室自建补骨脂化学成分库，该数据库包含补骨脂酚、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮等29种化学成分。以mol格式采用ISIS-Draw软件建构基于补骨脂化学组分的结构信息，充分运用Open Bable应用软件将分子的2D结构转变为3D结构，附加氢及Gasteiger电荷于结构，以mol2的格式保存文件。系统分析受体的构型，进而辨认受体的活性分布区域，在活性区域追踪可能的联结位点。探求与受体联结位点相适应的配体分子，获致备选化合物，对备选化合物展开评估和能量评级，并选取其作为下一阶段实验指标性成分。

2.2 对照品溶液制取

精密称取适量补骨脂甲素、补骨脂素对照品，依序置10 mL棕色容量瓶中，添至甲醇溶解，制得浓度为113 μg/mL、212 μg/mL的对照品储备液，稀释制得每1 mL溶补骨脂甲素21.2 μg、补骨脂素11.3 μg混合对照品溶液，供备用。

2.3 供试品溶液制取

精密称取补骨脂盐炙品粉末，过筛(60目)0.2 g，置25 mL容量瓶中，添至20 mL甲醇，超声波提取30 min，放冷，添入甲醇至刻度，摇匀，静置，微孔滤膜(0.45 μm)滤过即得。

2.4 色谱条件

色谱柱：Kromasil-C18(4.6 mm×250 mm，5 um)；
流动相：乙腈(A)-0.3%冰乙酸(B)，梯度洗脱(0～10 min，63%～55% B；
10～20 min，55%～50% B；
20～30 min，50%～45% B；
30～50 min,45%～35% B)；
流速：1.0 mL/min；
柱温：室温；
检测波长：245 nm；
进样量：10 μL。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察

精密汲取4、8、10、12、16、20 μL混合对照品液注入HPLC，精确测量。以混合对照品溶液进样量(μg)为横轴(X)，色谱峰面积为纵轴(Y)，绘出标准曲线，得补骨脂素回归方程Y=7 917 889.8729x + 16 451.5714，相关系数r=0.9992，线性范围0.0848～0.4240 μg；
补骨脂甲素回归方程Y=2 372 623.9892x+4 983.0000，相关系数r=0.9997，线性范围0.0848～0.4240 μg。

2.5.2 精密度试验

精密汲取混合对照品溶液，一日内连续5次进样，记录补骨脂素、补骨脂甲素色谱峰面积，计算得RSD分别为0.54%、1.26%，表明仪器精密度良好，见表1。

表1 精密度结果

2.5.3 稳定性实验

配制供试品溶液，依序置放0、4、8、12、16 h进样分析，记述补骨脂甲素、补骨脂素的色谱峰面积，计算得RSD分别为2.55%、2.31%，表明供试品溶液在该条件下稳定性良好，见表2。

表2 稳定性结果

2.5.4 重复性实验

精密称取同一批次5份盐炙补骨脂，按照“2.2”项下方法平行配制供试品溶液，进样分析，记述补骨脂甲素、补骨脂素色谱峰面积，计算得RSD分别为1.98%、0.62%，阐明该方法重复性良好，见表3。

表3 重复性结果

2.5.5 回收率实验

精密称取可知含量的6份盐炙补骨脂，每份依其1:1比例添补骨脂甲素、补骨脂素对照品，按照“2.2”项下方法配制，平均回收率分别为101.2%、98.5%，RSD分别为2.20%、1.90%，阐明此方式回收率较高，见表4。

表4 加样回收率试验结果(n=6)

2.6 星点设计与效应面分析

2.6.1 实验设计

基于Design-Expert 8.0.7.1软件的Central Composite 实验参数设计方案，撷取闷润时间(A)、炒炙时间(B)、炒炙温度(C)为实验研究三因素，以补骨脂素、补骨脂甲素两种成分总含量(mg/g)为响应值(Y)。参照星点设计分析方法，每一因素依次设立5水平，分别以±1.73、±1、0表示其自变量水平。代码见表5。采行上述软件展开多元回归拟合，制取二次多项回归模型。

表5 星点设计-效应面法实验设计表

3.1 分子对接

从蛋白质晶体结构数库PDB(http://www.rcsb.org/pdb)中获得CK，见图1，及其配体复合物的晶体结构(PDB code:3KWZ )视作分子对接的受体模型。补骨脂分子库存在8个分子可与CK顺利进行对接，并依循能量由低至高的次序排列，见表6。

图1 CathepsinK 的晶体结构

表6 分子对接打分表(kcal/mol)

3.2 星点设计及计算结果

见图7。

表7 星点设计与结果

3.3 模型拟合

Y=2.20+0.27A+0.12B-0.19C-0.0057AB+0.012AC-0.13BC-0.0065A2-0.25B2-0.23C2，其相关系数R2=0.9193，标示Y(两种成分的总含量)真实值与预估值之间有较优的拟合度，故该模型可用于预判补骨脂盐炙生产工艺。绘制各因变量曲面图，见图2。

图2 A、B、C三因素对两种成分总含量影响的效应面3D图

3.4 方差分析

表8可推断，在实验预设的区域范围内，A、B、C这3个因素对Y皆有显著影响。回归方程失拟检测并不显著，阐明实验结果受未知因素干涉极小。经F值验证标示总模型方程显著，此方程与实际情况有较佳拟合度。

表8 回归分析结果

系统分析，闷润补骨脂10.22 h，171 ℃炒炙12 min为其理想的盐炙工艺参数

计算机辅助药物设计(computer aided drug design，CADD)[17-23]是一种设计和优化先导化合物的方法，以计算机化学为基础，采取计算机的模拟、计算和预算药物与受体生物大分子之间的关系。中药现代化的已然进展，CADD被誉为连接传统中医药和现代科学的重要纽带，也为中药的药效物质基础研究提供了新方法。本研究将CK三维结构的活性位点和补骨脂中的化学分子进行对接，旨在利用分子虚拟筛选高通量、高速率、高准确性的优势，寻找中药补骨脂中CK的抑制剂。传统药理实验证明补骨脂素、补骨脂甲素具有较好的抑制破骨细胞活性作用，其在补骨脂中的含量也较高，分别属于香豆素类及黄酮类化合物，而豆科植物的黄酮类化合物具有植物雌激素样作用，可适度调节绝经后妇女的骨含量，是潜在的抗OP有效物质。根据补骨脂虚拟筛选结果和相关文献报道，进而选取CK抑制剂中的补骨脂素及补骨脂甲素作为后续实验的目标性成分。与传统筛选方法相比，省去了繁琐的实验步骤、节约实验成本、减少实验时间，为目标成分的快速筛选提供有力支撑。

星点设计-效应面法[24-30]是综合数学分析、统计分析方法复合于一体的援用于线性及非线性数据模型的实验设计方法，能够深入研究多因素的交互作用，甄选出相对较优条件，具有实验次数少、实验精度及预测性高等优点，弥补了正交设计和均匀设计的不足，使结果更加可靠。本研究采行星点设计-效应面法，采用Design-Expert 8.0.7.1软件分析，以抑制CK的补骨脂甲素、补骨脂素共含量为评价指标甄选理想盐炙补骨脂工艺，增强其抗OP作用。闷润补骨脂10.22 h，171 ℃炒炙12 min为其理想的盐炙工艺参数，具有科学性和实用性，为补骨脂盐炙品的扩大生产给予技术参考。

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