手机版
您的当前位置: 恒微文秘网 > 范文大全 > 专题范文 > 竞争法制备喹乙醇快速检测试纸条及其在鲫鱼检测中应用

竞争法制备喹乙醇快速检测试纸条及其在鲫鱼检测中应用

来源:专题范文 时间:2024-02-09 13:19:02

林勃勃 韦庆敏 刘 发 罗志辉,2,3

竞争法制备喹乙醇快速检测试纸条及其在鲫鱼检测中应用

林勃勃1韦庆敏1刘 发1罗志辉1,2,3

(1.玉林师范学院,广西 玉林 537000;
2.广西农产资源化学与生物技术重点实验室,广西 玉林 537000;
3.广西高校桂东南特色农产资源高效利用重点实验室,广西 玉林 537000)

目的:在胶体金免疫层析技术的基础上采用竞争法制备喹乙醇快速检测试纸条。方法:采用一锅法合成显色用的胶体金,调控柠檬酸钠的量,获得不同最大吸收波长的胶体金。通过对胶体金吸收波长、碳酸钾添加量等条件的优化,获得胶体金的最大吸收波长为522 nm、碳酸钾(0.2 mmol/L)添加量为15 μL的最佳条件,在此最优条件下制备试纸条,考察试纸条的方法学参数,并将制备好的试纸条检测实际样品。结果:随着喹乙醇浓度的减小(5.3×10-1mg/mL,5.3×10-7mg/mL),试纸条的控制线C线一直显色,而检测线T线逐渐清晰、显色,表明试纸条是准确的,检出限为5.3×10-7mg/mL,所有的检测在5~8分钟内能完成,并成功用于鲫鱼实际样品的检测。结论:该试纸条适用于对肉类中的喹乙醇残留进行高效灵敏的检测,有利于保障人们的食品安全。

喹乙醇;
胶体金;
竞争法;
快速检测;
试纸条

喹乙醇是一种化学添加剂,分子量较小,也称倍育诺、奥喹多司和喹酰胺醇等,因其具有广谱抗菌性、能使蛋白质同化和提高饲料转化率等优点而广泛用于家禽和水产产品饲养中,促进使动物加速生长[1]。但研究发现长期使用或用量过大,累积在体内的喹乙醇会引发人体各类疾病,甚至有着明显的致畸形作用或致癌现象,因此,国内外对喹乙醇的使用都用明显的限制[2-6]。2005年,我国明确规定喹乙醇不能用于家禽和水产养殖当中[7],然而,近年来,一些不法商家为了追求更大的利益和降低生产成本,不顾国家规定,滥用喹乙醇,关于食用含有喹乙醇残留的水产禽畜而引发的食品安全问题层出不穷[8]。因此,建立一种快速、便捷、灵敏、准确的喹乙醇检测现场快检方法迫在眉睫。

目前对喹乙醇进行检测的主要方法有:(1)液相色谱-质谱联用技术,曾静等[9]采用此方法检测水产品中喹乙醇残留量得出检出限为10 μg/kg,此方法的检出限低且回收率高,浓度在0.5 μg/L~500.0 μg/L时线性关系良好,适用于检测水产品中的喹乙醇残留;
(2)超高压色谱-质谱法[10,11],师真等[12]采用超高效液相色谱-串联质谱法测定罗非鱼中喹乙醇,测得检测限为0.005 mg/kg;
(3)免疫法,免疫法包括了胶体金免疫层析法[13,14]、酶联免疫分析法[15]、荧光微球免疫层析[16,17];
(4)电化学分析法[18],电化学分析法中能较好地对喹乙醇分析和测定的方法是溶出伏安法,有研究表明[19],使用溶出伏安法检测喹乙醇残留的检出限为7×10-1mol/L。(5)高效液相色谱法,谢小华等[20]采用ODS柱分离喹乙醇,并将此方法用于检测草鱼、鲫鱼等水产品的喹乙醇。这些方法大多具有灵敏度高、重复性好等特点,在食品、水产品安全检测中起到重要的作用。但这些方法大多数需要专业人员操作大型精密仪器进行检测,步骤较为繁琐,不适合现场大批量检测,而免疫层析法具有操作方便、检测时间短、设备便携等特点,可广泛适用于现场检测,进行大面积推广。

胶体金免疫层析试纸法是实现快速、便捷、灵敏、准确检测的方法之一[21,22],广泛用于生化[23,24]、环境[25]、食品[26,27]等方面的检测。然而,由于喹乙醇分子量较小,采用传统的双抗免疫夹心法来构建胶体金快速检测试纸条,结合位点较少,比较容易出现假阳性。因此,本研究提出采用竞争法制备喹乙醇的快速检测试纸条,以胶体金为显色剂,与喹乙醇抗体构建具有靶向性的捕获探针,采用喹乙醇-BSA作为检测线的捕获剂,通过待测样品中是否有喹乙醇与金标抗体共同竞争结合,在检测线上是否会显色来判断阳性或者阴性。如果检测线和质控线都显色,结果判断为阴性;
如果检测线不显色,质控线显色则检测结果为阳性。检测线的显色逐渐增强说明喹乙醇浓度越小,实现对喹乙醇实际样品定性和半定量检测。

1.1 材料与试剂

氯金酸(分析纯,天津市光复精细化工研究所);
柠檬酸三钠、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、甲醇、碳酸钾和牛血清白蛋白(BSA)(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);
喹乙醇(分析纯)、喹乙醇抗体和喹乙醇-BSA(生化试剂,试上海羽朵生物科技有限公司);
羊抗鼠二抗(IgG)(生化试剂,宁波高新区海辰生物科技有限公司);
样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水滤纸(上海金标生物科技有限公司);
鲫鱼购自玉林名山农贸市场。

1.2 仪器与设备

Cary 5000紫外可见分光光谱仪(美国安捷伦公司);
TecnaiG20透射电子显微镜(美国FEI公司);
H1850R台式低速自动平衡离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);

HM3035三维划膜喷金仪、CTS300数控裁条机、YK725压壳机(上海金标生物科技有限公司);
DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏仪器设备有限公司)。

1.3 胶体金的合成

本研究按照经典的柠檬酸三钠还原法制备胶体金[28],做适当修改。在实验前先将所有要用到的玻璃仪器放在王水浸泡25 min,再取出分别用蒸馏水、超纯水各洗3次,最后置于烘箱,烘干保存。拿出以上烘干仪器,用分析天平称量0.0326 g的柠檬酸三钠,用量筒量取100 mL超纯水加入到250 mL三颈烧瓶中,然后在100 ℃的水浴条件下加热回流,并不断搅拌15 min,加入925 μL的48 mmol/L mM的氯金酸,溶液首先出现灰蓝色,其次到蓝色、黑蓝色、紫红色,最终变为酒红色,变为酒红色后再持续加热搅拌15 min,即可得胶体金溶液,取下自然冷却、装瓶,于冰箱中2℃~8℃保存。

1.4 碳酸钾的用量

取5支离心管,分别往里加入1 mL胶体金,分别加入0 µL、15 µL、25 µL、35 µL、45 µL的0.2 mol/L 碳酸钾溶液,两个小时后,观察离心管中胶体金溶液的颜色,若仍保持为酒红色,则为最佳的用量以稳定溶液的弱碱性和离子强度。

1.5 金标探针制备与纯化

取1 mL的胶体金,加入10 µL的1 mg/mL喹乙醇抗体,充分震荡摇匀8 min,静止2 h,加入50 µL 10% BSA封闭,放置于冰箱内2℃~8℃保存过夜,所标记的探针以5 083 g进行离心10 min,用移液枪吸走上清液,弃去,留下的沉淀用pH为8的 Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)复溶,置于冰箱中2℃~8℃保存,待用。

1.6 试纸条的制备

试纸条组装按照经典的四步法进行[29,30]。首先,取出聚氯乙烯底板,测量底板每一部分的长度和宽度,进行每一部分原材料适宜宽度和长度的剪裁。接着,将喹乙醇-BSA和羊抗鼠二抗用XYZ三维划线膜喷金仪划线到NC膜上,同时将金探针喷于结合垫上。然后将样品垫、金标结合垫、NC膜和吸水垫依次组装在底板上,为了保证试纸条的流动性良好,在组装时各部分要有一定的重叠,重叠1 mm左右即可。最后,为保证试纸条的使用寿命,将制作好的试纸条用压壳机装壳,与干燥剂一同放入铝箔袋中封口保存。如图1所示。

图1 喹乙醇试纸条组装示意图和实物图

1.7 试纸条的检测原理与结果判定

喹乙醇是小分子物质,无法使用传统直接法或间接法检测,因此,采用竞争法来制备喹乙醇试纸条,如图1中A线为检测线(T线),包被喹乙醇-BSA;
B线为质控线(C线),包被羊抗鼠二抗(IgG)。将待测样液滴到样品垫,与金标探针反应,如果样品中含有喹乙醇,将与金标探针结合,检测线上的喹乙醇-BSA则无法捕获金标探针(被抑制),检测线不显色或显色弱,金标探针继续往前走,与质控线的二抗结合,显色,判定检测结果为阳性;
反之,若是待测样液中不含喹乙醇,金标探针则会与喹乙醇-BSA完全抗原结合,检测线强显色,多余的金标则探针继续往前与羊抗鼠二抗结合,质控线显色。需要特别注意的是,若是检测线与质控线都不显色,则判检测结果为无效。

1.8 待测样品前处理

取市场随机购买的鲫鱼,去皮,取肉,将其放入料理破壁机中搅碎,取5 g已搅碎均匀的鲫鱼肉样品,加入2.5 mL配制好的75%的甲醇水溶液进行充分的震荡,使其混合均匀,再放入离心机内,以2 836 r/min的转速离心8 min,取其上清液,底部残渣再加入50%的甲醇水溶液2.5 mL,重复步骤,将两次离心所得到的上清液进行合并,置于离心管中待用。

1.9 数据处理

紫外-可见光谱图在origin7.0完成,其他图是在photoshop CS3和PPT下处理完成。

2.1 胶体金纳米粒子表征

为了提高试纸的显色度,研究需要粒径均一的胶体金纳米粒子,所合成的胶体金溶液在522 nm处有单一的最大吸收峰,峰形对称,如图2A所示。采用电子显微镜对其进行表征,如图2B所示,所合成出纳米粒子的粒径大概在13 nm~15 nm,粒径均匀,颜色鲜艳适宜用作制备金标探针,可初步达到预期效果。

图2 胶体金溶液紫外-可见光吸收光谱和透射电子显微镜图

2.2 金标探针最佳碳酸钾含量的确定

为了保证胶体金的稳定性和弱碱性,优化了碳酸钾的不同量,金标探针在过夜之后通过目测可以观察到出现了较明显的颜色变化,如图3所示。在保持其他条件不变的情况下,往1-5号离心管中添加5 µL、15 µL、25 µL、35 µL、45 µL的0.2 mol/L 碳酸钾溶液,随着碳酸钾的加入越多,溶液的颜色逐渐变深。当所加入的体积为15 µL时,2号离心管的金标颜色仍然保持为酒红色,所测得pH为8,由此确定制备金标探针最适宜添加的碳酸钾的量为15 µL。

图3 不同量碳酸钾的金标探针图

2.3 不同最大吸收波长的胶体金对金标探针显色的影响

金标探针的质量对试纸条的检测结果至关重要,在金标探针制备完成时,好的金标探针为酒红色,喷到结合垫上烘干之后仍然为酒红色(图4A),完成试纸条组装,用样液进行检测时,随着样液的流动和探针的结合,在显色呈现出来的颜色为酒红色,且不滞留于NC膜上,检测结果显色良好;
若是颗粒较大的胶体金(最大吸收波长为530 nm)制作探针,在喷到结合垫烘干后为暗紫色(图4B),用样液进行试纸条检测时,金标流动性差,滞留在NC膜上,检测结果显色较差,甚至不显色。因此,为了提高检测灵敏度,在本研究中选用了最大吸收波长为522 nm的胶体金制作探针。

图4 不同最大吸收波长的胶体金(A为最大吸收峰为522 nm,B为最大吸收峰为530 nm)制备的探针显色对比图

2.4 所制备试纸条的检出限

配制系列喹乙醇标准溶液:5.3×101 mg/mL、5.3 mg/mL、5.3×10-1mg/mL、5.3×10-2mg/mL、5.3×10-3mg/mL、5.3×10-4mg/mL、5.3×10-5mg/mL、5.3×10-6mg/mL、5.3×10-7mg/mL,5.3×10-8mg/mL,依次分别取50 µL的标准溶液滴到制备好的试纸条进行检测,随着试纸的吸水性,溶液往另一边渗透,3 min后,在显色区有明显的红色条痕。结果如图5所示,随着浓度的的减小(5.3×101mg/mL~5.3×10-7mg/mL),控制线C线一直显色,检测线T线逐渐清晰、显色,这说明完全抗原与其特异性抗体已经结合成功,所检测结果为阳性,而到5.3×10-8mg/mL时T线和C线都显色,结果为阴性,实现了对溶液中喹乙醇的定性检测,同时也显示了本实验所制备的试纸条检出限为5.3×10-7mg/mL,整个检测过程在5~8分钟内完成。

2.5 测定水产品中的喹乙醇

在本研究中,以市场中的鲫鱼为检测对象,检验所制备的试纸条的实用性。买回来的鲫鱼按照“1.8”项的方法处理,获得待测液。同时,取五份待测液,分别加入不同浓度喹乙醇(0、5.0×10-6mg/mL、1.5×10-7mg/mL、5.0×10-7mg/mL、7.5×10-7mg/mL),按照本研究的方法进行检测,结果如图6所示,1号样品和5号样品的试纸条T和C线都出现两条红杠,说明检测结果是阴性。而2号、3号和4号样品试纸条都只有C线出现红杠,T线没有出现红杠,说明检测结果为阳性,加标样的实验结果与理论相符,说明所制备的喹乙醇试纸条具有较好的实用性和可靠性,可广泛应用于家禽和水产品中喹乙醇的测定。

图6 鲫鱼肉样品中喹乙醇的检测

本研究采用竞争法制备了喹乙醇快速检测试纸条。采用吸收波长为522 nm的胶体金作为显色剂,偶联喹乙醇抗体,构建喹乙醇的金标探针,考察探针的稳定性和检测限等条件,在最优条件下制备试纸条,获得所制备试纸条的检出限为5.3×10-7mg/mL,并在5~8分钟内完成对鲫鱼肉的检测,结果表明所制备试纸条具有较好的灵敏度和实用性,可广泛应用于家禽和水产品中喹乙醇的测定。

[1]BARBER R S, BRAUDE R, HOSKING Z D, et al. Olaquindox as performance-promoting feed additive for growing pigs[J]. Animal Feed Science and Technology, 1979, 4(2), 117-123.

[2]HAN J, JIANG D, CHEN T, et al. Simultaneous determination of olaquindox, oxytetracycline and chlorotetracycline in feeds by high performance liquid chromatography with ultraviolet and fluorescence detection adopting online synchronous derivation and separation[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 2020, 1152: 122253.

[3]GE L, GAO Y Q, HAN Z, et al. Administration of olaquindox impairs spermatogenesis and sperm quality by increasing oxidative stress and early apoptosis in mice[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2022, 234: 113396.

[4]LI D, ZHANG Y, PEI X, et al. Molecular mechanism of olaquindox-induced hepatotoxicity and the hepatic protective role of curcumin[J]. Food and Chemical Toxicology, 2020, 145: 111727.

[5]KHAN N A, AHMED S, FAROOQI I H, et al. Occurrence, sources and conventional treatment techniques for various antibiotics present in hospital wastewaters: A critical review[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2020, 129: 115921.

[6]BORRAS S, COMPANYO R, GRANADOS M, et al. Analysis of antimicrobial agents in animal feed[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2011, 30(7): 1042-1064.

[7]殷居易,倪梅林,寿成杰,等. 鸡肉中喹乙醇、卡巴多及其代谢物的残留检测[J]. 中国兽药杂志,2006,40(1): 11-15.

[8]HE S, WANG Q, Li S, et al. Antibiotic growth promoter olaquindox increases pathogen susceptibility in fish by inducing gut microbiota dysbiosis[J]. Science China(Life sciences), 2017, 60(11): 1260-1270.

[9] 曾静,朱宽正,王鹏,等. 高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中的喹乙醇[J]. 中国食品卫生杂志,2006,18(5): 423-425.

[10] 邹淼,蒋莹,冯静,等. 超高效液相色谱串联质谱法测定鸡蛋中喹乙醇及卡巴氧代谢物[J]. 食品安全质量检测学报,2020,11 (19): 6942-6946.

[11] 任龙梅. 超高效液相色谱-串联质谱法测定畜肉中喹乙醇和代谢物残留及其冷冻储藏稳定性研究[J]. 食品安全质量检测学报,2021,12 (11): 4559-4565.

[12] MIAO X, XU L, LI H, et al. Determination of olaquindox, carbadox and cyadox in animal feeds by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Food Additives and Contaminants, 2018, 35(7): 1257-1265.

[13] ZHANG H, QU W, DING C, et al. Tissue depletion of olaquindox and its six metabolites in pigs and broilers: Identification of a suitable marker residue[J]. Frontiers in Veterinary Science, 2021, 8: 638358.

[14] HASSANTABAR F, ZORRIEHZAHRA M J, Firouzbakhsh F, et al. Development and evaluation of colloidal gold immunochromatography test strip for rapid diagnosis of nervous necrosis virus in golden grey mullet (Chelon aurata) [J]. Journal of Fish Diseases, 2021, 44 (6): 783-791.

[15] CHENG L, SHEN J, WANG Z, et al. A sensitive and specific ELISA for determining a residue marker of three quinoxaline antibiotics in swine liver[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405(8): 2653-2659.

[16] WANG Q, HOU M L, LIU L P, et al. New method for ultra-sensitive P24 antigen assay based on near-infrared fluorescent microsphere immunochromatography[J]. Biomedical and Environmental Science, 2020, 33(3): 174-182.

[17] WU Y, ZHANG J, YANG X, et al. Early diagnosis of ocult blood of colorectal cancer based on nano-colloidal gold sandwich immunochromatography[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology, 2021, 17(8): 1525-1534.

[18] LIU D, WANG A, ZHOU J, et al. A label-free electrochemical immunosensor based on AuNPs/GO-PEI-Ag-Nf for olaquindox detection in feedstuffs[J]. Microchemical Journal, 2022, 177: 107287.

[19] STARA V, KOPANICA M. Determination of some quinoxaline-N-dioxide derivatives by adsorptive stripping voltammetry[J]. Analytica Chimica Acta, 1986, 186: 21-30.

[20] 谢小华,周德山,宋向明,等. 高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇残留量[J]. 理化检验(化学分册),2011,47(1): 102-103.

[21] KUMAR P, SARKAR N, SINGGH A, et al. Nanopaper biosensors at point of care[J]. Bioconjugate Chemistry, 2022, 33(6): 1114-1130.

[22] SENATORRALBA A, ALVAREZDIDK R, PAROLO C, et al. Toward next generation lateral flow assays: Integration of nanomaterials[J]. Chemical Reviews, 2022, 112(18): 14881-14910.

[23] LI J, WU T, WANG C, et al. Nanogapped Fe3O4@Au surface-enhanced raman scattering tags for the multiplex detection of bacteria on an immunochromatographic strip[J]. ACS Applied Nano Materials, 2022, 5(9): 12679-12689.

[24] FAHEEM A, QIN Y, NAN W, et al. Advances in the Immunoassays for Detection of Bacillus thuringiensis Crystalline Toxins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(36): 10407-10418.

[25] SU L, WANG L, XU J, et al. Competitive lateral flow immunoassay relying on Au–SiO2 janus nanoparticles with an asymmetric structure and function for furazolidone residue monitoring[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(1): 511-519.

[26] MILLS C, DILLON M J, KULABJUSAN P K, et al. Multiplex lateral flow assay and the sample preparation method for the simultaneous detection of three marine toxins[J]. Environmental Science and Technology, 2022, 56(17): 12210-12217.

[27] WU S, LIU L, DUAN N, et al. Aptamer-based lateral flow test strip for rapid detection of zearalenone in corn samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(8): 1949-1954.

[28] FRENS G. Controlled nucleation for regulation of particle-size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature Physical Science, 1973, 241(105): 20-22.

[29] WU Y, ZHOU Y, LENG Y, et al. Emerging design strategies for constructing multiplex lateral flow test strip sensors[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2020, 157: 112168.

[30] CHENG Y, GE W, KUANG H, et al. Gold-based immunochromatographic strip for rapid ketoconazole detection[J]. Microchemical Journal, 2022, 174: 107083.

Preparation of Rapid Detection Strip of Olaquindox for Competitive Method and Its Application in the Detection of Crucian Carp

Objective: On the basis of colloidal gold immunochromatography technology, competitive method was used to prepare rapid test strips for olaquindox. Methods: The colloidal gold for color development was synthesized by one pot method, and the amount of sodium citrate was adjusted to obtain colloidal gold with different maximum absorption wavelengths. By optimizing the absorption wavelength of colloidal gold and the addition amount of potassium carbonate, the maximum absorption wavelength of colloidal gold was 522 nm and the addition amount of potassium carbonate (0.2 mmol/L) was 15 μL, prepare the test strip under this optimal condition, investigate the methodological parameters of the test strip, and test the actual sample with the prepared test strip. Results: With the decrease of olaquindox concentration (5.3×10-1mg/mL, 5.3×10-7mg/mL), the control line C of the test strip showed color all the time, while the detection line T was gradually clear and colored, indicating that the test strip was accurate, and the detection limit was 5.3×10-7mg/mL, all tests could be completed within 5 to 8 minutes, and successfully used for the detection of actual samples of crucian carp. Conclusion: The test strip is suitable for the highly efficient and sensitive detection of olaquindox residues in meat, which is conducive to ensuring the safety and health of human food.

olaquindox; colloidal gold; competitive method; rapid detection; test strip

O657; S91

A

1008-1151(2022)12-0034-05

2022-09-29

国家自然科学基金(22064018);
广西自然科学基金(2019JJA120031、2019GXNSFAA245026);
玉林市科技攻关项目(201934012);
学校高层次人才科研启动项目(G2020ZK04、G2021ZK15);
广西教育厅人才项目(2018-18);
学生创新项目(201910606143)。

林勃勃(1998-),女,玉林师范学院学生,从事食品快速方法研究。

罗志辉,男,玉林师范学院教授,从事纳米材料的制备及其分析应用、食品安全检测研究。

猜你喜欢碳酸钾金标检测线金标劲酒中华建设(2023年1期)2023-02-08碳酸钾能够提高猪肉品质河南畜牧兽医(2021年9期)2021-12-10机动车检测线实验室中信息工程技术的研究与应用时代汽车(2021年18期)2021-09-17碳酸钾结构及热稳定性研究杭州化工(2020年1期)2020-05-09汽车检测线远程智能诊断系统研究设备管理与维修(2020年2期)2020-03-24真空碳酸钾脱硫废液提取副盐的试验研究山东冶金(2019年6期)2020-01-06一种快速车流量检测算法哈尔滨理工大学学报(2016年4期)2016-11-10四川盐湖化工销售有限公司董事长罗永成:碳酸钾可作为水溶性肥料的优质原料中国农资(2015年14期)2015-01-31金标伪影对CyberKnife射野剂量学影响的计算与测量医疗卫生装备(2014年11期)2014-03-17大理州试验推广斑点金标免疫渗滤诊断技术云南畜牧兽医(2014年2期)2014-02-28

恒微文秘网 https://www.sc-bjx.com Copyright © 2015-2024 . 恒微文秘网 版权所有

Powered by 恒微文秘网 © All Rights Reserved. 备案号:蜀ICP备15013507号-1

Top