漆酶Lcc9在灰盖鬼伞菌中的同源过表达

张晶娜， 周 刚， 刘娟娟， 方泽民， 肖亚中

(安徽大学 生命科学学院 现代生物制造安徽省重点实验室安徽省微生物与生物催化工程技术研究中心，合肥 230601)

漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一类可以催化酚类和非酚类化合物氧化的含铜多酚氧化酶。一般情况下，4个底物分子在漆酶的I型Cu位置分别失去1个电子；
4个电子经电子传递链达到三铜中心与氧分子结合，将后者还原为2分子水[1]。漆酶由于催化底物范围宽、以水为唯一产物等优势，被认为是“绿色”的生物催化剂，在环境废水处理、天然产物转化、新材料制备、新型电极研发等领域具有重要应用价值[2]。来自Phomasp. UHH 5-1-03的漆酶可以去除废水中85%的药物活性化合物[2]；
基于漆酶的生物传感器已被用于测定食品、环境中的酚类物质[3]；
Yang等[4]以漆酶等为材料制备了一种新型生物传感器，用于检测对苯二酚的电催化性能，显示出选择性高、重复性和稳定性好等优良性能。

研究显示，真菌、植物、细菌和昆虫等的基因组中均包含漆酶编码基因。但是，真菌和细菌依然是漆酶的主要来源[5]。据统计，目前发现的漆酶超过80%来源于真菌，包括子囊菌门、担子菌门和半知菌门真菌[6]。相比较，细菌来源的漆酶占比为10%左右，来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等的漆酶如CotA等已被克隆。与细菌漆酶相比，真菌漆酶具有氧化还原电势高、比活力高、底物范围广等优势，已成为微生物学、植物保护学、生物化工等领域的研究热点[7-8]。然而，真菌漆酶发酵制备周期长、表达量低，主要在酸性条件下(pH 3.5～5.5)发挥最佳活性，当pH值>7时活性基本为零，限制其在部分工业领域中的应用[9]。发现在中碱性条件下具有高效催化活力的真菌漆酶并实现其高效制备对拓展漆酶的应用至关重要。

课题组前期通过将灰盖鬼伞菌(CoprinopsiscinereaOkayama7#130，OK7)与球托霉菌w5(Gongronellasp. w5)共培养，获得漆酶Lcc9。该漆酶具有在中碱性条件下发挥最佳催化活性和碱性稳定性等优势，可高效催化靛蓝转化，在纺织整染领域具有潜在应用价值[10]。在共培养条件下，Lcc9的最大表达量约为1.8 U/mL[10]。将Lcc9的cDNA克隆至毕赤酵母(Pichiapastoris)表达后，酶活力达到3.1 U/mL[11]。在此基础上，本文利用双孢蘑菇(Agaricusbisporus)组成型gpdII启动子控制漆酶Lcc9[12]，利用酿酒酵母同源重组技术构建lcc9过表达载体，以实现其在灰盖鬼伞菌株FA2222和OK7中的同源过表达，提高Lcc9的表达水平并为Lcc9的后续研究奠定基础。

1.1 材料与试剂

C.cinereaOkayama7#130(OK7，ade8-)由美国北卡罗莱纳大学教堂山分校Patricia J. Pukkila教授惠赠，菌株C.cinereaFA2222(FA2222，trp-)、质粒pYSK-lcc1、pAde8、pBD5由哥廷根大学Ursula Kües教授惠赠。基因lcc9克隆质粒保存于本实验室。引物的合成、测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Y1H购自Takara(日本)生物公司；
大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
DNA凝胶回收试剂盒、DNA质粒抽提试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；
酵母质粒抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；
纤维素酶与几丁质酶购自Sigma-Aldrich化学(德国)有限公司；
GF-1控时调速式高速分散器购自海门市麒麟医用仪器厂；
ABTS购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。其他化学试剂均为国产或进口分析纯。SD/-ura固体培养基(配方见Takara《酿酒酵母转化用户手册》)用于酿酒酵母转化子筛选，YPDA(2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖及0.012%腺嘌呤半硫酸盐)用于酿酒酵母的液态培养，再生培养基[12]与最简培养基[12]分别用于灰盖鬼伞阳性转化子初筛和复筛，YMG固体培养基(0.4%葡萄糖、0.4%酵母提取物、1%麦芽提取物、1%琼脂粉)用于灰盖鬼伞菌株活化，Kjalke培养基(2%酵母提取物、3%葡萄糖、0.05%CaCl2·H2O、0.2% KH2PO4、0.005% MgSO4·7H2O)用于灰盖鬼伞的液态发酵产漆酶。

1.2 方法1.2.1 pYSK-lcc9质粒的构建

根据lcc9基因序列设计一对含有pYSK质粒同源片段的上下游引物，lcc9-F：ACATCCACCATCTCCGTTTTCTCCCATCTACACACAACAAGCTTATCGCCATG-TCCAGGAAACTTTTCTCTCTCGCCT；
lcc9-R：TGACTATAGCAGCCTCCTACCACTGGCCCTCTGGTCAACTATAAT-ATTATTTAAGGAGTGGGGACAATTTGGATAGAGGTG(下划线为同源臂片段)。通过PrimeSTAR聚合酶扩增目标基因lcc9，PCR扩增条件：98 ℃预变性2 min；
98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min 50 s，30个循环；
72 ℃再延伸10 min。质粒pYSK-lcc1经限制性内切酶BamH I和HpaI双酶切处理后回收载体片段，并与含有同源臂的lcc9片段共转化进入酿酒酵母Y1H感受态细胞，进行同源重组(图1)。转化菌株于SD/-ura固体培养基培养3～5 d直至单克隆出现。挑取单克隆酵母菌落至3 mL YPDA液体培养基，在30 ℃ 250 r/min条件下培养1～2 d后，参照酵母质粒抽提试剂盒操作步骤抽提酿酒酵母质粒。按照大肠杆菌热激转化步骤将酿酒酵母质粒转化进大肠杆菌细胞以增加其拷贝数，挑取单克隆于LB培养基培养12～16 h，抽提质粒并测序。

F为上游同源臂片段；
R为下游同源臂片段。Lcc9的表达由香菇启动子PgpdII启动，由漆酶基因lcc1终止子终止。图1 质粒pYSK的结构及基因替换策略Figure 1 Structure of plasmid pYSK and strategy of gene replacement

1.2.2C.cinerea的转化及筛选

按照《分子克隆与实验指南》中的质粒提取操作步骤抽提pYSK-lcc9、pAde8与pBD5质粒。将pYSK-lcc9与pAde8质粒共转化进OK7原生质体细胞；
pYSK-lcc9与pBD5质粒共转化进FA2222原生质体细胞。灰盖鬼伞菌原生质体制备及DNA共转化操作步骤参照Kilaru等[12]的研究。转化的细胞涂布于再生培养基并于37 ℃条件下培养直至转化子出现。每天挑取转化子并计数。挑取的转化子转移至含有0.5 mmol/L ABTS的最简培养基中进行阳性克隆复筛。

1.2.3 阳性克隆的液态发酵、酶活力测定及活性电泳检测

在YMG平板上挑取4块边长约0.5 cm的菌块，接入YMG液体种瓶培养基(100 mL/500 mL)，120 r/min，37 ℃培养4 d后匀浆(350 W，28 000 r/min，5 s)；
按照体积分数为5%的接种量接种至Kjalke(加入终浓度为0.1 mmol/L Cu2+)培养基中(100 mL/500 mL)，继续培养5～7 d，每隔24 h取样并监测漆酶活力变化。

漆酶活力测定采用ABTS法进行，具体为取950 μL酒石酸钠缓冲液(100 mmol/L，pH 4.0)，加入33 μL15 mmol/L ABTS和适当稀释的酶液17 μL，充分混匀后30 ℃水浴3 min，冰浴30 s终止反应，在λ=420 nm波长下测定反应液的光吸收值。漆酶活力计算公式：E(U/L)=OD420×稀释倍数×555.56。

通过活性-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)检测发酵液中的漆酶表达情况。具体操作步骤：将稀释一定倍数的发酵液上清液与2×上样缓冲液混匀后，点样10 μL至活性胶胶孔内，于VE-180A微型垂直电泳槽中80 V电压电泳30 min后，120 V继续电泳3 h。取下活性胶并于100 mmol/L pH 4.0酒石酸钠缓冲液(0.5 mmol/L ABTS)中室温孵育，待浅蓝色条带出现，停止孵育并拍照取图。

1.2.4 FA2222-lcc9菌株的3 L发酵罐发酵制备

按照1.2.3步骤活化FA2222菌株、匀浆并按5%接种量接至3 L发酵罐，选择Kjalke培养基(含终浓度0.1 mmol/L的Cu2+)于37 ℃、50 r/min、初始pH值为5.8条件下发酵培养菌株，期间保持菌体溶氧(DO)为20%左右。每隔12 h取样并测定漆酶活力。发酵结束后，用管式离心机8 000 r/min离心10 min收集发酵液上清液，保存于4 ℃备用。

2.1 lcc9过表达载体的构建

根据酿酒酵母同源重组原理(图1)，当lcc9起始同源臂长度设计为30 bp时，仅有14.3%的酵母转化子包含同源重组的lcc9过表达载体pYSK-lcc9；
当同源臂长度增加至50 bp时，比例增加至100%。

(a)转化子在再生培养基上的初筛；
(b)和(c)分别为单转和共转的转化子在最简培养基上的复筛。图2 阳性转化子的初筛与复筛Figure 2 Primary and re-screening of positive transformants on agar plates

2.2 C.cinerea阳性转化子的筛选

pYSK-lcc9共转化入OK7和FA2222原生质体后，为了确保获得阳性转化子，对转化子进行初筛和复筛实验。经再生培养基初筛[图2(a)]以及包含0.5 mmol/L底物ABTS最简培养基复筛[图2(b)和(c)]，共获得pAde8单转化OK7转化株56株，pYSK-lcc9与pAde8共转化OK7转化株75株；
获得pBD5单转化FA2222转化株36株，pYSK-lcc9与pBD5共转化FA2222转化株64株(表1)。与单转化比较，质粒共转化有效提升了转化效率，分别为1.34倍/OK7和1.78倍/FA2222。经进一步复筛，获得阳性OK7-lcc9共转化株46株，阳性FA2222-lcc9共转化株29株。

表1 单载体转化及单载体与pYSK-lcc9共转化转化子数目统计Table 1 Transformations of C. cinerea with vector alone,or using same batches of protoplasts,in combination with pYSK-lcc9 laccase gene derivatives

2.3 液态发酵、漆酶活力测定及活性电泳检测

因目的基因随机整合进灰盖鬼伞基因组，且整合入基因组的拷贝数不同，随机挑取2株pAde8、2株pBD5转化菌株、5株pAde8与pYSK-lcc9，以及5株pBD5与pYSK-lcc9共转化阳性菌株进行液态摇瓶发酵。选择的发酵培养条件：在Kjalke液体培养基中接种5%匀浆的阳性菌株种子液于37 ℃进行发酵。

结果显示，所有OK7阳性转化菌株均在第7天达到最高酶活力，共转化阳性菌株中pAde8+pYSK-lcc9-1活力最高，为21.1 U/mL± 1.2 U/mL，pAde8+pYSK-lcc9-4活力最低，为5.1 U/mL± 0.5 U/mL。单转化pAde8的漆酶活力最高为1.1 U/mL± 0.3 U/mL[图3(a)]。漆酶过表达后活力提高4.6～19.2倍不等。相比较，FA2222的共转化阳性菌株在第6天达到最高酶活力，在共转化菌株中pBD5-pYSK-lcc9-4的漆酶活力最高，为12.3 U/mL± 1.1 U/mL，pBD5-pYSK-lcc9-2的漆酶活力最低，为3.7 U/mL± 0.3 U/mL，而pBD5单转化FA2222菌株只检测到极其微量的漆酶活力，约为5.1×10-2U/mL[图3(b)]。漆酶过表达后活力提高72.5～241.2倍。

(a)OK7; (b)FA2222。图3 OK7、FA2222菌株液态摇瓶发酵漆酶活力Figure 3 Laccase activity of OK7 and FA2222 strains in liquid cultures

对发酵液上清液同工酶谱检测分析结果显示，所有OK7-lcc9及FA2222-lcc9菌株均主要表达Lcc9(图4)，与酶活力测定结果一致。同时，OK7-lcc9菌株少量表达漆酶Lcc5和痕量的Lcc1[10]。对照单独转化pAde8的菌株也有本底水平的Lcc9以及Lcc5和Lcc1的表达[图4(a)]。相比较，同工酶谱检测发现FA2222-lcc9菌株仅表达Lcc9蛋白，而pBD5单转化菌株几乎无漆酶蛋白表达[图4(b)]。

(a)OK7; (b)FA2222。图4 OK7、FA2222菌株发酵液上清液同工酶谱Figure 4 Isozyme spectrum of OK7 and FA2222 strains

2.4 OK7-lcc9和FA2222-lcc9菌株的3 L高密度发酵

选取OK7-lcc9(pAde8+pYSK-lcc9-1)和FA2222-lcc9(pBD5+pYSK-lcc9-4)菌株，在3 L发酵罐中开展漆酶的发酵制备研究。结果表明，OK7-lcc9菌株发酵液上清液最高酶活力仅为8 U/mL，低于摇瓶发酵酶活力[图5(a)]。相同条件下，FA2222-lcc9的3 L发酵结果显示，菌株在108 h时达到最高漆酶活力59 U/mL，相比普通摇瓶发酵，漆酶活力进一步提高了4.8倍[图5(b)]。

(a)OK7; (b)FA2222。图5 OK-lcc9、FA2222-lcc9菌株3 L高密度发酵漆酶活力Figure 5 Laccase activity of OK-lcc9 and FA2222-lcc9 in 3 L bioreactor

对OK7-lcc9与FA2222-lcc9在发酵罐中的菌球形态进行比较。OK7-lcc9菌球相对较松散，菌球表面呈不规则状态，有大量菌丝凸起。相比较，FA2222-lcc9菌球结构更加紧凑、密实，表面较为光滑(图6)。基于对菌球表面形态的连续观察和监测，推测OK7-lcc9菌球在发酵罐的剧烈搅拌条件下更易破裂，不利于漆酶合成和分泌。

图6 OK7与FA2222菌球形态Figure 6 Photographs of pellets in the supernatant OK7 and FA2222

表2 不同方法制备C. cinerea来源漆酶的比较Table 2 Comparison of the results of different strategies for the preparation of C. cinerea laccase

异源表达是高效制备酶蛋白的重要手段，多项研究显示漆酶基因能够以子囊菌为宿主进行异源制备，获得的最高酶活力为11.0 U/mL(以ABTS为底物)[17]。但异源表达存在菌株密码子偏好、糖基化等问题，使得酶性质与野生型相比差异较大[18-19]。例如，Pycnoporuscinnabarinus野生型漆酶Lcc1分子质量为70.0 ku，而其Pichiapastoris异源表达产物因过度糖基化分子质量增加至110.0 ku[20]。在另外一项研究中，虽然漆酶在Aspergillussp.中的异源表达产物分子质量变化不大，但酶学性质如pH值、Km和氧化还原电势等明显不同[20]。相比较，同源过表达不但能显著提高漆酶产量，而且因宿主的遗传背景相同保留原有的酶学性质，是漆酶工业化应用的重要技术保障。本研究利用同源过表达和高密度发酵技术制备了C.cinerea漆酶蛋白Lcc9，与C.cinerea漆酶的其他制备方法相比(表2)，大大提高了Lcc9的制备效率。

遗传转化是制约担子菌遗传学改造和工业化应用的关键环节。PEG/CaCl2介导的原生质体转化法操作简单，已被广泛应用于多种担子菌中。其中，原生质体的制备效率和转化参数如PEG的浓度、CaCl2浓度和pH值等是该方法成功的基础。本研究中经优化后C.cinerea的转化效率为250～350个转化子/μg DNA，高于其他担子菌的研究[21]。此外，与前人研究结果一致[22]，质粒共转化有效提升了转化效率，分别为1.34倍/OK7和1.78倍/FA2222。共转化较单载体转化效率更高的可能原因是：一方面，在单载体转化过程中，产生色氨酸(pBD5)、腺嘌呤(pAde8)反馈抑制现象而抑制大量转化子的生长；
另一方面，目的基因通常是在多个位置异位整合进灰盖鬼伞基因组中的，在共转化过程中两个载体竞争整合，减少了反馈抑制，进而转化效率得以提高。

阳性菌株经5%接种量、Kjalke培养基培养后，OK7阳性转化子漆酶活力较野生型提高了4.6～19.2倍，FA2222阳性转化子漆酶活力较野生型提高了72.5～241.2倍。因目的基因是随机整合进C.cinerea基因组中的，且整合进基因组的拷贝数有差异[23]，进而不同转化子表现出不同的漆酶合成能力，未来可通过转化子进一步筛选获得高产漆酶的工程菌株。

FA2222-lcc9的3 L高密度发酵实验，使得漆酶活力提高4.8倍，但OK7-lcc9经3 L反应器发酵，漆酶活力未见提升。通过菌体形态学观察，推测OK7-lcc9菌球在发酵罐的剧烈搅拌条件下更易破裂，不利于漆酶合成和分泌。未来可通过形态学改造即增强OK7细胞壁结构的柔韧度，使其适应高密度发酵制备漆酶。

猜你喜欢漆酶同源酵母以同源词看《诗经》的训释三则汉字汉语研究(2021年2期)2021-08-30“铤”有“直”义的词源学解释——兼说/直/义的同源词族汉字汉语研究(2019年2期)2019-08-27同源宾语的三大类型与七项注意新高考·英语进阶（高二高三）(2018年8期)2018-01-15以竹粉为基质固态培养虫拟蜡菌及其产漆酶条件研究安徽农学通报(2017年8期)2017-05-12高鲜型酵母抽提物的开发进展中国调味品(2017年2期)2017-03-20人CyclinD1在毕赤酵母中的表达现代检验医学杂志(2016年5期)2016-08-20虔诚书画乃同源河北书画研究(2016年3期)2016-04-28生物量高的富锌酵母的开发应用中国科技信息(2015年2期)2015-11-16青霉菌产漆酶的研究及在木质素降解中的应用湖北农业科学(2014年10期)2014-09-22香灰菌传代对银耳栽培的影响江苏农业科学(2014年4期)2014-07-11