LC-MS法测定新型VMAT2抑制剂LPM3770164中的樟脑磺酸酯

曹丽晓,付婷婷,李兆琴,薛 英,于文浩,张星星,车 鑫

(1. 烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,山东 烟台,264005;2. 绿叶制药集团有限公司长效和靶向制剂国家重点实验室,山东 烟台,264003)

LPM3770164为突触囊泡单胺转运体(vesicular monoamine transporter,VMAT)2抑制剂,用于治疗迟发性运动障碍(Tardive dyskinesia,TD)或亨廷顿舞蹈症(Huntington"s disease,HD)[1]。目前已上市的VMAT2抑制剂有三种:丁苯那嗪、氘代丁苯那嗪和缬苯那嗪。丁苯那嗪和氘代丁苯那嗪均为外消旋体,其代谢产物种类较多,会产生抑郁和自杀倾向的黑框警告[2-4]。缬苯那嗪是丁苯那嗪主要活性代谢产物[+]-α-二氢丁苯那嗪的前药,提高了药物的靶点选择性和特异性,去除了前两种药物的黑框警告,但该药物的生物利用度较低,具有代谢排泄压力和心脏的安全性风险[5-8]。LPM3770164则是基于缬苯那嗪的临床治疗学缺陷,针对其活性代谢产物[+]-α-二氢丁苯那嗪进行结构改造,设计合成更优新化合物,预期最终获得治疗TD或HD的靶向VMAT2抑制剂的1类新药。

基因毒性杂质在较低水平就有可能引起DNA的损伤并可能引发癌变,对患者的用药安全产生严重危害,所以药物中遗传毒性杂质的控制和监测成为药物开发和生产的一个关键问题[9]。EMA、FDA和ICH均颁布了与基因毒性杂质相关的指导原则[10],为制药企业对杂质的控制提供了相关指导。樟脑磺酸作为拆分剂,广泛应用于手性化合物的合成中。LPM3770164为单一手性结构化合物,在其制备工艺中使用樟脑磺酸作为手性拆分剂,而樟脑磺酸很容易与工艺路线中使用的醇溶剂甲醇、乙醇反应生成潜在基因毒性杂质樟脑磺酸甲酯(MCS)和樟脑磺酸乙酯(ECS)[11],其化学结构式如图1所示。目前暂未查到MCS、ECS的相关毒理学数据,根据基于专家知识规则的Derek和基于统计学的Sarah两类构效关系软件评估结果,MCS、ECS属于ICH M7指导原则中第3类基因毒杂质(具有警示结构,与原料药结构无关,无致突变性数据)。为保证LPM3770164用药安全性,有必要对MCS、ECS进行测定,并制定合理的限度。

图 1 MCS、ECS的化学结构式

根据LPM3770164临床拟定的服药剂量,参考EMA关于基因毒性杂质限度的相关指南[12],对于结构相似的基因毒性杂质,杂质的总量应不超过毒理学关注阈值(TTC)即1.5 μg·d-1,得到MCS、ECS的限度约为10 ng·mL-1。为了实现这种痕量水平的定量,需要开发灵敏、准确的分析方法。对于磺酸酯类基因毒性杂质的测定,欧洲药典附录[13]中收载了一种在线衍生化顶空GC-MS法,以碘化钠作为衍生试剂进行衍生,逐渐成为一种通用方法,但该方法所采用的防止NaI氧化的硫代硫酸钠对方法的耐用性有不利影响[14],并且采用衍生化间接测定可能会由于反应特异性不强而造成假阳性结果[15]。RAMAN等[16]采用GC-MS法测定樟脑磺酸甲酯与樟脑磺酸乙酯,其检测限和定量限分别为150 ng·mL-1和500 ng·mL-1,检测灵敏度无法满足限度需求。因此,本课题采用具有较高的灵敏度和选择性的LC-MS法进行直接测定,并进行相应的方法学研究,为LPM3770164的工艺和质量控制提供参考依据。

1.1 仪器

Agilent 1290 超高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Agilent 6470 三重四级杆质谱仪,配置喷射流离子聚焦技术(Jet Stream)的AJS ESI源(美国Agilent公司);ACQUITY UPLC Peptide CSH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美国Waters科技公司);梅特勒电子天平XS105(瑞士Mettler Toledo公司);梅特勒电子天平PB-403S(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 试药

MCS(批号:11-RCD-92-2,纯度:97%,多伦多化学研究有限公司);ECS(批号:4-RVK-176-2,纯度:94%,多伦多化学研究有限公司);乙腈(HPLC纯,德国Merck公司);乙酸铵(HPLC纯,上海安谱科技股份有限公司);娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团);LPM3770164(批号:20200824、20200825、20201207,山东绿叶制药有限公司)。

2.1 色谱-质谱条件

2.1.1 色谱条件 采用色谱柱ACQUITY UPLC Peptide CSH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm),以10mmol·L-1乙酸铵溶液-乙腈(90∶10,V/V)为流动相A,乙腈为流动相B,采用梯度洗脱[0 min(80% A-20% B)→10 min(20% A-80% B)→10.1 min(80% A-20% B)→15 min(80% A-20% B)],流速为0.3 mL·min-1,柱温35 ℃,进样量为10 μL。

2.1.2 质谱条件 单四级杆质谱,采用电喷雾离子源(ESI)正离子化的选择离子监测(SIM)模式测定。MCS、ECS的目标离子[M+NH4]+质荷比分别为264.5、278.5,碎裂电压(Fragmentor)分别为85 V、90 V。干燥器温度为300 ℃,干燥器流速为5 L·min-1,鞘气温度250 ℃,鞘气流速5 L·min-1,毛细管电压4 kV,喷嘴电压1500 V,雾化气压力为35 psi,监测时间为4～7.7 min,其余时间色谱系统中流出物均不进入质谱分析。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合杂质对照品溶液 精密称取MCS、ECS各约25 mg,置25 mL量瓶中,加空白溶液(V(乙腈)∶V(水)=1∶1)溶解并稀释至刻度,摇匀,分别制成MCS、ECS对照品贮备溶液。精密量取上述对照品贮备溶液1.0 mL,置同一100 mL量瓶中,加空白溶液稀释至刻度,摇匀,制成10 μg·mL-1的混合溶液。精密量取混合溶液1.0 mL,置100 mL量瓶中,加空白溶液稀释至刻度,摇匀,即得0.1 μg·mL-1的混合杂质对照品贮备液。精密量取混合杂质对照品贮备液5.0 mL,置50 mL量瓶中,加空白溶液稀释至刻度,摇匀,得到质量浓度约为10 ng·mL-1混合杂质对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取供试品约25 mg,精密称定,置25 mL量瓶中,加适量空白溶液超声溶解,稀释至刻度,摇匀,即得。

2.3 方法学验证

2.3.1 系统适用性 将“2.2.1”项下的混合杂质对照品溶液,按照上述色谱-质谱条件连续进样6针,记录色谱图,分别计算MCS、ECS峰面积的RSD。MCS、ECS的RSD分别为2.5%、2.4%,结果见表1,表明仪器精密度良好。

表1 系统适用性试验考察结果

2.3.2 专属性试验 将“2.2”项下空白溶液、混合杂质对照品溶液和供试品溶液分别进样,记录色谱图。结果见图2,MCS、ECS的保留时间分别为5.398、6.295 min,空白溶液和供试品溶液对MCS、ECS测定均无干扰,该方法的专属性良好。

图2 LPM3770164中2个樟脑磺酸酯基因毒性杂质LC-MS法检查专属性试验

2.3.3 线性与范围 精密量取“2.2.1”项下混合杂质对照品贮备液1.0、1.5、3.0、4.0、5.0和7.5 mL,分别置50 mL量瓶中,用空白溶液稀释至刻度,制成MCS、ECS质量浓度分别约为2、3、6、8、10、15 ng·mL-1的系列标准曲线溶液,按上述色谱-质谱条件分别进样分析,记录色谱图。以溶液的质量浓度X(ng·mL-1)与峰面积Y作标准曲线,得MCS、ECS的线性回归方程见表2,结果表明MCS、ECS分别在1.97～14.79 ng·mL-1、1.90～14.26 ng·mL-1浓度范围内呈现良好的线性相关性。

表2 线性考察结果

2.3.4 定量限和检测限 精密量取“2.2.1”项下的混合杂质对照品溶液,用空白溶液逐级稀释,按上述色谱-质谱条件进样分析,记录色谱图,按照定量限S/N≥10的要求,得到定量限溶液。MCS、ECS的定量限浓度分别为1.97 ng·mL-1、1.90 ng·mL-1。将定量限溶液连续进样6针,MCS、ECS的信噪比均大于10,MCS峰面积RSD为3.6%,ECS峰面积RSD为2.5%,结果见表3,该方法的灵敏度符合要求。

表3 定量限考察结果

精密量取定量限溶液3.0 mL,置于10 mL量瓶,加空白溶液稀释至刻度,摇匀,即得检测限溶液。MCS、ECS的检测限浓度分别为0.59 ng·mL-1、0.57 ng·mL-1,连续进样2针,MCS、ECS的信噪比均大于3。

2.3.5 加样回收率试验 取供试品约50 mg,精密称定,置50 mL量瓶中,加适量空白溶液超声使溶解,并分别精密加入混合杂质对照品储备液1.0、5.0、7.5 mL,加空白溶液稀释至刻度,制成MCS和ECS低(定量限)、中(100%)、高(150%)三种不同加样浓度水平的供试品溶液,分别平行配制3份。按上述色谱-质谱条件分别进样分析,记录色谱图,计算回收率,结果见表4。MCS、ECS的平均加样回收率(n=9)分别为98.5%、99.1%,表明该方法准确度良好。

2.3.6 重复性试验 因供试品溶液中未检出各杂质,采用供试品加标溶液来评估方法的重复性。按照“2.3.5”项下方法制备中浓度加样水平供试品溶液6份,按上述色谱-质谱条件分别进样分析,记录色谱图。通过回收率来计算RSD,结果见表4。MCS、ECS的RSD(n=6)分别为2.1%、2.2%,表明该方法重复性良好。

表4 加样回收率和重复性试验结果

2.3.7 溶液稳定性试验 将“2.2.1”项下的混合杂质对照品溶液和“2.3.5”项下100%加样浓度水平的供试品溶液分别于8 ℃样品盘中放置,在0～36 h间不同的时间点,分别进样分析,记录色谱图,将各时间点对照品溶液、加标供试品溶液的峰面积与0 h测定结果进行比较,通过计算回收率来确定对照品溶液与加标供试品溶液的稳定性。结果见表5,MCS、ECS各对照品溶液及加标供试品溶液于8 ℃下放置,在36 h内稳定。

表5 溶液稳定性试验结果

2.4 样品检测

按照上述色谱-质谱条件,对3批LPM3770164样品(20200824、20200825、20201207)的MCS、ECS进行检测,记录色谱图,按外标法计算杂质的含量。结果如图2(d)所示(以20201207样品为例),在该方法的检测灵敏度下,MCS、ECS在3批样品中均未检出,满足其在样品中的限度要求。

3.1 分析方法的选择

对于磺酸酯类杂质,欧洲药典附录[13]中收载的衍生化HS-GC-MS法,以碘化钠为衍生化试剂,与甲磺酸酯、对甲苯磺酸酯和苯磺酸酯等反应生成挥发性较好的碘代烷烃,通过测定碘代烷烃来计算药物中磺酸酯类杂质的量,该方法通用性较好,但无法区分不同类的磺酸酯。根据实际的工艺路线和质量控制的需求,不同潜在的磺酸酯类杂质需要在不同的控制位点进行质控,若采用该药典方法,专属性无法保证。考虑到樟脑磺酸甲酯、樟脑磺酸乙酯的沸点均较高(分别为382.9 ℃、395.9 ℃),采用GC-MS法进行直接测定响应较低,RAMAN等[16]采用的GC-MS法测定埃索美拉唑中的MCS、ECS,为了达到较高的灵敏度,将供试品的浓度定为50 mg/mL。而LPM3770164的溶解性较低,无法达到此浓度,该方法的灵敏度不能满足本研究的限度需求。因此，本研究最终选择采用LC-MS法进行直接测定,其专属性强,灵敏度高,操作更加简便。

3.2 色谱条件的选择

方法开发初期采用超高效液相色谱进行条件的摸索,因樟脑磺酸甲酯、樟脑磺酸乙酯间极性差异小,不易分离,同时药物中有其他杂质干扰目标峰的测定,为确保MCS、ECS进入质谱后具有较好的离子化效率,所以选择柱效较高的Waters ACQUITY UPLC Peptide CSH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱进行分离,实验考察了梯度1[0 min(80% A-20% B)→10 min(20% A-80% B)→10.1 min(80% A-20% B)→15 min(80% A-20% B)]、梯度2[0 min(80% A-20% B)→15 min(20% A-80% B)→15.1 min(80% A-20% B)→20 min(80% A-20% B)]两个梯度,对比两个梯度的结果,MCS、ECS间的分离度接近,选择保留时间较短、灵敏度较高的梯度1进行洗脱。

3.3 质谱条件的选择

由于MCS和ECS在紫外检测器下响应较差,无法满足样品方法学验证中灵敏度的要求,故选择在质谱检测器下进行后续的方法开发。选用单四级杆质谱进行SIM模式检测时,全扫描模式下,MCS、ECS的母离子在流动相条件下主要以[M+NH4]+的形式存在且峰响应较稳定,所以将[M+NH4]+峰264.5、278.5分别作为MCS、ECS的定量离子。SIM模式下,筛选Fragmentor,考察质谱响应,结果表明樟脑磺酸甲酯在85 V下响应较高,樟脑磺酸乙酯在90 V下响应较高。最后进行离子源参数优化,通过依次调节鞘气温度及流速、喷嘴电压、毛细管电压、雾化气压力、干燥气温度及流速等,考察质谱响应,来满足灵敏度的要求。为避免样品基质对仪器的污染和杂质测定的干扰,根据杂质的出峰时间选择质谱的监测时间,使得方法的灵敏度更高。

综上所述,本研究建立了LC-MS法测定LPM3770164中樟脑磺酸甲酯、樟脑磺酸乙酯,经方法学验证结果表明,其专属性、线性、加样回收率、重复性等结果良好,检测限分别达到0.59 ng·mL-1、0.57 ng·mL-1,满足药物中樟脑磺酸甲酯、乙酯的限度需求。该方法操作简便,专属性强,灵敏度高,可以有效测定出LPM3770164中樟脑磺酸酯的含量,保证药物的质量安全,同时可为其他药物中樟脑磺酸酯的测定提供方法参考。

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