超细SiO2改性壳聚糖膜的制备、表征及蛋白质分离性能研究

龙 腾，陈义强，柯文林，唐 旭，徐长安，吴 鹏*

(1.福建中烟工业有限责任公司技术中心，福建 厦门 361021；
2.自然资源部第三海洋研究所，福建 厦门 361005)

海洋中存在丰富的植物多糖、动物多糖和微生物多糖，其中作为动物多糖的甲壳质最为丰富，从虾、蟹等海产品加工废弃物中可以提取20%～30%的甲壳素，是目前仅次于纤维素的第二大多糖类物质[1-3]。壳聚糖是甲壳素脱去乙酰基形成的衍生物，是一种天然的阳离子型海洋生物多糖，与甲壳素不同，壳聚糖可在稀酸条件下溶解，扩大了其应用范围[4]。壳聚糖具有广谱抗菌性、生物可降解性、成膜性等特点，科学家们以壳聚糖为原料在海洋膜材料方面做了大量的研究，在生物医学、食品化工、环境保护等领域拓展其应用潜力[5]。壳聚糖是矩阵规则排列的聚合物大分子，与水分子形成氢键能力强，能在膜表面形成一层水化层可阻止蛋白质、多糖等生物质膜污染物在表面吸附，抗膜污染能力强[6-7]，因此壳聚糖在膜材料的应用，尤其在超滤膜和纳滤膜的制备方面发挥着重要作用[8-9]。以臭氧处理过的聚丙烯无纺布为基材，涂覆壳聚糖醋酸溶液制备复合膜，具有抗蛋白质和细菌粘度的功能，在膜生物反应器中使用具有通量高和抗膜污染性能等优点[10]。壳聚糖/硅胶/聚乙烯醇的有机-无机杂化超滤膜可用于蛋白质分离[11]，该膜具有非对称结构和相对致密的表面层和多孔层，对牛血清白蛋白和溶菌酶溶液分离中表现出较高的通量、较好的选择性和抗膜污染性能。以壳聚糖为膜材料，通过京尼平交联成功制备的自支撑壳聚糖膜用于微藻细胞分离的研究发现，通过改变聚乙二醇的分子量可实现膜微结构的调控，并且小分子聚乙二醇结构改性的壳聚糖膜比大分子聚乙二醇结构改性的壳聚糖膜对小球藻细胞本身及其代谢产物形成的膜污染具有更好的抑制作用[12]。目前应用壳聚糖膜制备复合膜的研究比较多，主要以商用超滤膜(聚偏氟乙烯、聚醚砜等)为支撑层，通过涂覆、界面聚合等方法制备[13-14]。虽然壳聚糖本身是生物可降解材料，但是支撑层材料为石化产品，直接丢弃对环境仍然会造成一定程度的污染。自支撑壳聚糖膜主要通过流延法制备[15-16]，其缺点主要是膜厚度大而造成膜通量低。所以，如何在自支撑膜基础上做一定的改性既要保证分离精度，又要改善膜通量而且能保持一定的力学强度成为当前主要的研究课题。本研究利用壳聚糖在碱性条件下稳定，超细SiO2在碱性条件下能溶解的特殊结合，通过在壳聚糖铸膜液中添加一定量的超细SiO2使其自然沉淀，采用“凝胶成膜-溶解脱除”方法成功制备出具有致密层和多孔层的非对称结构的自支撑壳聚糖膜，并对该自支撑壳聚糖膜的结构和纯水通量进行表征，并考察其对蛋白质的分离效果。本研究以壳聚糖为原料制备改性壳聚糖膜对海洋生物产业，尤其是生物酶制剂产业发展及环境保护等均有重要参考价值和指导意义。

1.1 实验材料

壳聚糖(高分子量，分子量为310～375 kDa)购自西格玛奥德里奇公司；
高纯SiO2超细粉(规格5～15 μm，纯度大于99.99%)购自连云港瑞创新材料有限公司；
醋酸、氢氧化钠、甘油，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；
溶菌酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、鸡卵清蛋白和牛血清白蛋白均为生化试剂，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 改性壳聚糖膜的制备与结构表征 准确称取1 g的壳聚糖粉末溶解于99 g的醋酸水溶液，在室温下搅拌12 h至其完全溶解，制备质量分数为1%壳聚糖水溶液。所得壳聚糖溶液用滤纸进行减压过滤以除去溶液中的非溶解性杂质。本研究所使用的超细SiO2的粒径主要分布在5～15 μm之间，粒径分布详见图1。将含壳聚糖30%(质量分数)的甘油添加到过滤后的壳聚糖溶液后，再添加不同质量的超细SiO2(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g)，将超细SiO2在壳聚糖溶液中充分分散。取配好的壳聚糖铸膜液(30 g，约25 mL)倒入内径为90 mm的玻璃培养皿中，超细SiO2通过自由沉降至铸膜液底部，从Stokes公式可知，颗粒沉降速度、颗粒密度和流体密度相关，在颗粒密度和流体密度不变的情况下，颗粒直径越大，沉降速度就越大。经过12 h的沉降，超细SiO2堆积在铸膜液底部，将培养皿置于电热鼓风恒温干燥箱中并保持水平放置，在60 ℃下干燥12 h。干燥后将事先配好的1.5 mol/L的NaOH水溶液倒入玻璃培养皿中让壳聚糖膜在碱性条件下凝固成膜。然后将壳聚糖/SiO2复合膜从玻璃培养皿中取出并移至70 ℃、1.5 mol/L NaOH水溶液中浸泡，同时缓慢搅拌5 h，以溶解并去除壳聚糖膜内的SiO2。采用数码相机和美国产的Quanta 450型扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)对壳聚糖膜的形貌及表面微观结构进行观察。

图1 超细SiO2的粒径分布Fig.1 Size distribution of the ultrafine SiO2 particles

1.2.2 壳聚糖膜的含水率及机械性能测试 壳聚糖膜样品含水率的测试方法：将壳聚糖膜样品切成4 cm×4 cm的小片，在纯水中浸泡24 h后，用滤纸小心擦去样品表面的水滴，置于电热鼓风恒温干燥箱中，60 ℃干燥12 h。其计算公式如下：

(1)

式(1)中：Wt为壳聚糖膜的含水率(%)，ws为干燥前质量(g)，wd为干燥后质量(g)。

壳聚糖膜样品机械性能的测试方法：将壳聚糖膜片裁剪成10 mm×40 mm的规格，膜厚使用测厚仪(7301系列，日本)测试。准备好膜片固定在万能试验机(5900系列，美国)上进行拉伸测试。最初的夹具间距设置为20 mm，拉伸速率为1 mm/s。

1.2.3 壳聚糖膜水通量测试 平板超滤系统由超滤杯(KS-90，日本)、氮气瓶、减压阀和计算机组成，膜样品的水通量测试按恒压力死端过滤模式进行。壳聚糖膜放置于超滤杯底部，杯中装400 mL的纯水在恒定氮气压力(0.1 MPa)的驱动下，透过壳聚糖膜，有效测试膜面积为45.3 cm2。通过壳聚糖膜的纯水流入放置在电子天平上的烧杯内，计算机实施采集并记录电子天平数据及其对应时间。壳聚糖膜水通量由公式(2)计算得出。

(2)

式(2)中：J为水通量[L/(m2·h)]，ΔV为透过液体积(L)，Am为有效膜面积(m2)，t为膜过滤时间(h)。

1.2.4 壳聚糖膜内蛋白质传质通量测定 采用自制的玻璃扩散膜池开展蛋白质扩散实验，如图2所示，将壳聚糖膜夹在两个圆柱型的玻璃扩散池之间，为了容易辨认，将左边进料端装入带有颜色的水溶液，右边的扩散端装入无色透明的纯水，扩散面积为50.2 cm2。一个玻璃扩散池装有0.1 g/L的蛋白质溶液600 mL[溶菌酶 (14 kDa)、胰蛋白酶 (20 kDa)、胃蛋白酶 (34 kDa)、鸡卵清蛋白 (43 kDa) 或牛血清白蛋白 (65 kDa)]，另一个扩散池装有纯水600 mL。每个扩散池各配有1台小型电动搅拌器，保持池内溶液处于湍流状态以减少浓差极化对蛋白质自由扩散的影响。实验过程中，每隔30 min分别从两个扩散池中取样1 mL，采用考马斯亮蓝法测定样品中蛋白质含量。

1为玻璃扩散池(进料端),2为小型叶片式电动搅拌器，3为壳聚糖膜，4为玻璃扩散池(扩散端)。图2 扩散膜池Fig.2 Diffusion membrane cells

基于扩散单元浓度的质量平衡，总传质系数和膜内传质系数可由公式(3)和(4)分别计算得出。

(3)

(4)

由于实验过程中始终保持两个扩散单元中的完全湍流条件，可以忽略总传质阻力中的壳聚糖膜两侧传质阻力，因此蛋白质分子在壳聚糖膜内传质系数可以用有效扩散系数(effective diffusion coefficients,Deff)与膜厚度的比值表示，即km=Deff/l。其中，Deff为蛋白质分子在壳聚糖膜中的有效扩散系数(m2/s)，l为膜的厚度(m)。

2.1 壳聚糖膜的结构表征与性能研究

图3(a)为超细SiO2改性壳聚糖膜的示意图。均匀分散在壳聚糖铸膜液中的超细SiO2颗粒随着时间的推移缓慢沉降在玻璃培养皿的底部，当壳聚糖凝胶成膜后再溶解脱除超细SiO2颗粒，壳聚糖膜的结构形态从两面均匀变成一面致密和一面多孔的非对称结构。图3(b)和图3(c)为超细SiO2改性前和改性后的壳聚糖膜的数码照片。如图可见，改性前壳聚糖膜为透明膜片，经过超细SiO2改性后的壳聚糖膜透明度有所降低。这是因为壳聚糖膜内的超细SiO2在碱性条件下溶解以后留下的超细多孔结构产生光散射效应所致。

图3 超细SiO2改性壳聚糖膜形成机制图及其数码照片Fig.3 Mechanism of chitosan membrane modified with ultrafine SiO2 particles and its digital photographs(a)为超细SiO2改性壳聚糖膜示意图，(b)为纯壳聚糖膜的数码照片，(c)为改性后壳聚糖膜的数码照片。

超细SiO2改性壳聚糖膜的表面及横断面SEM分析结果如图4所示。从图4(a)和图4(b)可以看出超细SiO2颗粒在有限的薄层内构建出了非对称结构，由于致密层(或称之为分离层)的厚度大大降低，将在提高膜渗透通量方面发挥关键作用。图4(c)和图4(d)分别为铸膜液与玻璃培养皿底部接触面和空气接触面所形成的膜结构图。铸膜液与玻璃培养皿底部接触面也就是超细SiO2沉降堆积侧，经过碱处理后呈现多孔结构，而与空气接触侧则呈现致密的膜结构。

图4 超细SiO2改性壳聚糖膜SEM图Fig.4 SEM image of chitosan membrane surface modified by ultrafine SiO2

2.2 壳聚糖膜的含水率与机械性能

为了验证在壳聚糖膜中溶解脱除超细SiO2颗粒形成偏心定位的空隙，我们比较了壳聚糖膜和改性壳聚糖膜的含水率变化，如图5(a)所示，改性壳聚糖膜的含水率比壳聚糖膜有一定程度的增大。该结果表明，改性壳聚糖膜内含有一些微尺度空隙，这对膜通量的提高具有一定作用。另一方面，图5(b)对比了壳聚糖膜和改性壳聚糖膜在承受最大应力方面的表现，结果显示，经过超细SiO2改性对壳聚糖膜的机械性能几乎没有产生影响，虽然改性壳聚糖膜存在多孔微结构，但是在力学性能上与壳聚糖膜相比略有下降，其影响不大，具备实际应用中所需的机械强度。

图5 表面改性前后壳聚糖膜的含水率和机械性能Fig.5 Water content and mechanical properties of chitosan membranes before and after surface modification

2.3 壳聚糖膜的纯水通量

水是最常用的介质，一般用纯水通量来评价膜材料的渗透能力。如图6所示，随着超细SiO2添加量的增加，改性壳聚糖膜的纯水通量越来越大，这是因为超细SiO2的溶解脱除形成多孔结构会增加壳聚糖膜多孔层的比表面积，一些文献也报道了增加的比表面积会增大气体分离[17]、渗透蒸发[18]和反渗透[19]中的渗透通量。另外，由于改性壳聚糖膜为非对称结构，其致密层的厚度比壳聚糖膜小，水分子扩散通过致密层的时间短，因此纯水通量会提高。当壳聚糖与超细SiO2的质量比为1∶1时，改性膜纯水通量比壳聚糖膜高出1.5倍，超细SiO2的添加量超过1.0 g时，纯水通量呈现了下降的趋势，可能是因为在本研究实验条件(在1.5 mol/L的NaOH、70 ℃处理5 h)下，不能完全溶解脱除壳聚糖膜内的超细SiO2，使得分子在扩散过程中受到阻碍导致纯水通量下降。另一方面，也有关于渗透通量与表面粗糙度之间关系的研究提出了相互矛盾的结果，其中水渗透通量并不总是随着表面粗糙度的增加而增加[20-21]，因为膜比表面积不随SiO2颗粒的添加量成比例变化。例如，壳聚糖膜本身的传质通道可能被过多的SiO2颗粒所影响，导致水渗透通量下降。因此，加入过量的SiO2颗粒可能会导致透水率下降。

图6 超细SiO2的添加对膜纯水通量的影响Fig.6 Effect of ultrafine SiO2 addition on pure water flux of membrane

2.4 壳聚糖膜对蛋白质分子传质能力评价

图7为模式蛋白质分子量大小对膜传质的影响，所使用膜为未处理壳聚糖膜和改性壳聚糖膜(壳聚糖和超细SiO2的质量比为1∶1)。通过测量溶菌酶(14 kDa)、胰蛋白酶(20 kDa)、胃蛋白酶(34 kDa)、鸡卵清蛋白(43 kDa)和牛血清白蛋白(65 kDa)在壳聚糖膜内的传质通量来研究壳聚糖膜对蛋白质分子的分子筛能力。结果表明，虽然所用模式蛋白质从最高分子量(牛血清蛋白65 kDa)到最低分子量(溶菌酶14 kDa)的变化约4.6倍，但是这些模式蛋白在改性壳聚糖膜中Deff变化达330倍，并且改性壳聚糖膜中鸡卵清蛋白和牛血清蛋白之间Deff出现了急剧变化，因此，我们认为传质通道的大小几乎等于鸡卵清蛋白的分子大小[22]。另一方面，图7还显示了壳聚糖膜和改性壳聚糖膜Deff的对比，改性壳聚糖膜中蛋白质分子的Deff比壳聚糖膜大，尤其是在相对较小的分子范围内的蛋白质，说明经过改性后的壳聚糖膜对较小分子量范围的蛋白质分子有更大影响。

图7 蛋白质分子在膜内的有效扩散系数Fig.7 Effective diffusion coefficients of protein molecules in membranes图中坐标系为对数坐标系。

在本研究中，超细SiO2被成功地应用于制作具备非对称结构的改性壳聚糖膜。SEM观察显示，超细SiO2沉积在铸膜液底部，因此溶解脱除后的改性壳聚糖膜顶部表面致密、光滑且平坦，而底部则呈现多孔结构。该结构一方面可降低壳聚糖膜致密层的厚度，另一方面可增大膜内部物质扩散的有效面积。在纯水通量方面，改性壳聚糖膜的渗透性比原壳聚糖膜高1.5倍。当壳聚糖与超细SiO2的质量比为1∶1时，其纯水通量达到最大。模式蛋白质自由扩散实验结果显示，改性壳聚糖膜对蛋白质的分子尺寸筛选具有较高的灵敏度。本研究为具有自支撑且非对称结构的壳聚糖膜材料的研究提供了参考，本研究成果在生物酶制剂制备等富含蛋白质料液的处理方面具有广泛的研究和应用前景。

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