烟草TPP基因家族鉴定及表达模式分析

刘 涛，郭 存，邹宗庆，金立权，吴 健，文利超，邓智超，初雨蒙，王凌涛，李 伟，郭永峰

烟草TPP基因家族鉴定及表达模式分析

刘 涛1,2，郭 存3，邹宗庆4，金立权5，吴 健5，文利超1,2，邓智超1,2，初雨蒙1,2，王凌涛6，李 伟1*，郭永峰1*

（1.中国农业科学院烟草研究所，烟草行业基因资源利用重点实验室，青岛 266101；
2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；
3.云南省烟草公司昆明市公司石林分公司，昆明 650000；
4.福建省烟草公司龙岩市公司，福建 龙岩 361000；
5.山东临沂烟草有限公司兰陵分公司，山东 临沂 277700；
6.湖北省烟草公司十堰市公司竹溪县营销部，湖北 十堰 442300）

海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）是植物海藻糖代谢过程的关键酶，在植物的生长发育及非生物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。为挖掘参与烟草发育及抗逆胁迫的TPP基因家族成员，本研究通过生物信息学的方法，在普通烟草基因组中共鉴定出了15个基因，其中7个基因定位在染色体上。系统进化分析发现，新鉴定的烟草TPP成员可分为3个亚家族，分别为CLASS I、CLASS II和CLASS III。共线性分析表明，有5个烟草基因分别与7个拟南芥基因形成同源基因对。启动子分析发现，NtTPP成员的启动子上存在多种激素和非生物胁迫响应元件。表达模式分析发现，基因表达具有一定的组织特异性，大部分基因在根中的表达量最高，有12个基因在干旱胁迫下表达量上调，13个基因能够被盐胁迫显著诱导表达。这说明NtTPP基因家族成员在烟草非生物胁迫应答中发挥着重要作用。

烟草；
海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）；
干旱胁迫；
盐胁迫；
表达模式

海藻糖是一种非还原性双糖，由两分子α-葡萄糖组成，广泛分布于植物、动物以及微生物中[1]。研究发现海藻糖在植物应对各种生物以及非生物胁迫中发挥重要作用[2]。在极温、高渗透压及干燥失水等胁迫条件下，海藻糖能在细胞表面形成特殊的保护膜，降低逆境对生物分子结构的损害，维持生命体的生命过程和生物特征[3-4]。

海藻糖在植物中的合成主要包括以下两个步骤：第1步，通过海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS），尿苷二磷酸-葡萄糖（UDPG）和葡萄糖-6-磷酸葡萄糖（G6P）合成一种磷酸化中间体海藻糖-6-磷酸（T6P）；
第2步，海藻糖-6-磷酸（T6P）在海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）催化下去磷酸化合成海藻糖[5-6]。TPP是海藻糖合成途径的限制性酶，在高等植物中广泛分布，随着植物全基因组测序的进行，TPP基因家族已在多种物种中被鉴定[7-9]，主要特征是它们都含有一个Trehalose_PPase保守结构域。基因已被证实参与拟南芥[10-11]、水稻[12-14]、玉米[15-16]等多种植物的非生物胁迫响应。在烟草中，外源施加海藻糖不仅能够提高烟苗的抗旱能力，还能钝化烟草花叶病毒进而减轻病毒对烟叶的伤害[17-18]。WANG等[19]从普通烟草中克隆出了基因，发现热胁迫可显著提高基因的转录水平，同时NaCl、PEG和低温胁迫也可轻微诱导其表达。

烟草是我国重要的经济作物，在烟草的生长发育过程中，干旱、低温、机械损伤、病虫害等非生物和生物胁迫，均会导致烟叶减产降质，造成经济损失。而海藻糖在植物抗逆过程中发挥重要作用，TPP作为合成海藻糖的关键酶，在烟草中的基因功能鲜有研究。因此，本研究利用比较基因组学和生物信息学手段，对烟草基因组中的TPP基因家族进行全面鉴定和分析，包括：系统进化分析，基因结构及TPP蛋白保守结构域分析，共线性分析，启动子顺式作用元件分析，组织特异性和非生物胁迫表达模式分析，为进一步明确基因功能和烟草抗逆品种培育奠定基础。

1.1 试验材料、试剂、仪器

材料：普通烟草品种K326，保存于中国农业科学院烟草研究所。将烟草种子先用75%酒精和过氧化氢消毒后，在超净工作台上播种到MS培养基上，转至人工气候室培养，温度23 ℃，每天光照16 h，黑暗8 h。待其长出4片真叶后，移到MS液体培养基上培养（对照），以300 mmol/L甘露醇MS液体培养基模拟干旱处理，以100 mmol/L NaCl MS液体培养基作为盐胁迫处理，培养0、1、3和6 h后分别取8株。

试剂：康为世纪RNA提取试剂盒（FFPE DNA/RNA Kit）、康为世纪反转录试剂盒（HiFi-MMLV cDNA Kit）。

仪器：ABI公司Veriti96 PCR仪和7500型荧光定量PCR仪。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草TPP家族鉴定及基本特征分析 从TAIR（https://www.arabidopsis.org）数据库中下载拟南芥TPP家族成员的蛋白序列作为种子序列在烟草基因组数据库（ftp://ftp.solgenomics.net/ genomes/Nicotiana_tabacum/）中进行同源比对搜索（BLASTP，E值<100）。获得的序列在Pfam（http://pfam.xfam.org/）数据库中对其保守结构域分析[20]，因为TPP家族成员都包含Trehalose_PPase结构域（PF02358），因此去除不含Trehalose_PPase结构域的序列。利用在线网站Expasy（http://www. expasy.org/tools/protparam.html）中的ProtParam计算蛋白长度、分子量和等电点[21]。

1.2.2 系统进化分析 在NCBI数据库（https://www. ncbi. nlm.nih.gov/）中下载水稻和小麦的TPP基因家族蛋白质序列。使用MEGA X软件对拟南芥、小麦、水稻和烟草的TPP基因家族蛋白质序列进行多序列比对（MUSCLE法）和构建系统进化树（邻接法，bootstrap设置为1000）[22]。

1.2.3 烟草TPP家族基因结构及蛋白质保守结构域分析 在茄科数据库（http://solgenomics.net/）中下载普通烟草K326的CDS和gDNA序列，从中提取TPP基因家族的信息，通过在线网站GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析其基因结构[23]。使用在线工具MEME（http://meme.sdsc.edu/meme）分析NtTPP基因家族成员的保守结构域[24]。

1.2.4 启动子和共线性分析 在NCBI中提取烟草TPP基因家族上游2000 bp的启动子序列，利用在线工具PlantCARE（http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）检测顺式作用元件，筛选后用TBtools软件进行可视化。将拟南芥和K326全基因组进行比对，对其共线性进行分析，建立同源基因对[25]。

1.2.5 基因表达模式分析 从NCBI的GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）中下载EDWARDS等[26]2017年发布的普通烟草K326转录组数据（GSE95717），提取不同组织和低温、干旱胁迫下的转录组数据，进行分析。

1.2.6 RNA提取和Real-time PCR分析 取对照、干旱和盐处理0、1、3和6 h共4个时间段的烟草幼苗各8株，提取RNA，再反转录获得cDNA。根据基因的CDS序列，使用qPrimerDB-qPCR Primer Database（https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/）在线数据库设计qRT-PCR引物（表1）。将提取的cDNA稀释20倍作为qRT-PCR的模板。以作为内参基因，每个样品3次重复，最终试验结果采用2-ΔΔCt方法进行分析。

表1 qRT-PCR引物信息

2.1 NtTPP基因家族鉴定和理化性质分析

以拟南芥的TPP家族成员的蛋白质序列为种子序列，在烟草基因组数据库中进行BLASTP检索，获得候选烟草TPP基因家族成员。利用Pfam数据库对候选成员保守结构域分析后，筛选得到15个烟草TPP基因家族成员，其中有7个基因定位在染色体上。通过Prot Param工具分析烟草TPP基因家族成员的理化性质，结果表明其蛋白质长度在223～435个氨基酸之间，分子量在25 705.3～ 48 902.13 Da之间，等电点在6.31～9.68之间（表2）。

2.2 NtTPP基因家族系统进化分析

为进一步了解烟草TPP家族成员的进化关系，对单子叶植物（水稻、小麦）和双子叶植物（拟南芥、烟草）的共62条蛋白质序列进行比对，并构建进化树（图1）。按照之前的文献报道[7]，我们将系统进化树分为4个分支即CLASS Ⅰ、CLASS Ⅱ、CLASS Ⅲ和CLASS Ⅳ。其中CLASS Ⅱ只包含3个NtTPP基因家族成员，表明这3个基因与其他几个物种的亲缘关系较远。NtTPP在亚家族CLASS Ⅰ和CLASS Ⅲ的成员数目均为6个，但在亚家族CLASS Ⅳ中并没有NtTPP家族成员。

表2 普通烟草TPP基因家族鉴定及理化性质分析

图1 普通烟草TPP基因家族的系统进化分析

2.3 NtTPP基因结构和蛋白质保守基序分析

对NtTPP基因家族成员的基因结构分析发现（图2），外显子数目最多的是，包含13个外显子，最少的是，仅有6个外显子。CLASS Ⅰ亚家族的外显子数目为6～10个，CLASS Ⅱ亚家族8～10个，CLASS Ⅲ亚家族10～13个。其中和的外显子、内含子数目一致，均为11个，并且其位置和长度非常相似，表明这两个基因在进化关系上极其保守。

用MEME软件对NtTPP基因家族成员的蛋白质序列进行分析（图2），共鉴定出15个保守基序（Motif 1～15）。CLASS Ⅰ和CLASS Ⅲ亚家族的保守基序均为8～12个，CLASS Ⅱ亚家族中仅有4个保守基序，其余两个均为8个。其中Motif 1（TPP结构域）在烟草NtTPP基因家族中高度保守，该结构在海藻糖-6-磷酸磷酸酶（TPP）去磷酸化过程中起着重要的作用。值得注意的是，Motif 11仅存在于CLASS Ⅲ亚家族，Motif 14仅存在于CLASS Ⅰ亚家族，暗示这两个亚家族功能可能比较特异。

2.4 NtTPP基因家族启动子分析

分析上游调控序列有助于解释基因调控的机制，进而预测其潜在功能[27]。使用在线工具PlantCARE，对NtTPP基因家族成员的上游2000 bp序列进行顺式作用元件分析（图3）。结果表明，在12个基因（、、、、、、、、、、和）的启动子区域检测到与干旱响应相关的顺式作用元件（MBS）；
在13个基因（、、、、、、、、、、、和）的启动子区域检测到与脱落酸响应相关的顺式作用元件（ABRE）；
在9个基因（、、、、、、、和）的启动子区域检测到与防御和逆境响应相关的顺式作用元件（W-box、富含TC重复序列）。除此之外，NtTPP基因家族的启动子区域还包含茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、生长素响应元件、乙烯响应元件、机械伤害响应元件、厌氧响应元件和低温响应元件。值得注意的是含有5个脱落酸响应元件，含有高达8个防御和逆境响应的顺式作用元件。表明NtTPP基因家族与烟草的抗逆相关。

图2 普通烟草TPP基因家族的基因结构及保守基序分析

图3 普通烟草TPP基因启动子区顺式作用元件分析

2.5 NtTPP基因家族的共线性分析

对烟草基因的潜在生物学功能进行分析，探索新基因与已经充分研究的基因的关系，通过共线性分析建立拟南芥与烟草之间的同源基因对（图4）。分析结果表明，普通烟草与拟南芥为同源基因对，与、和为同源基因对，与和为同源基因对，与为同源基因对，与为同源基因对。烟草中有5个基因与拟南芥的7个基因形成共线对。

图4 普通烟草和拟南芥的共线性分析

2.6 NtTPP基因家族表达模式

利用普通烟草转录组数据对基因在不同组织的表达模式分析，结果表明（图5），基因在不同组织中的表达量变化较大。大部分基因在根中的表达量最高，在茎尖的表达量最低，包括CLASSⅠ亚家族的、和，CLASS Ⅱ亚家族的、和，CLASS Ⅲ亚家族的和。CLASS Ⅰ亚家族的和在茎中表达量较高，但在茎尖中表达量非常低。

对烟草转录组数据库中的低温和干旱数据进行分析发现，低温处理1 d，CLASS Ⅲ亚家族的、和表达量明显上调，但CLASS Ⅰ亚家族的和表达量出现下调趋势。干旱处理1 d时，和表达量明显上调，表达量下调较多。此外，、和表达量随着处理时间的增加逐渐上升，在干旱处理8 d时达到最高。

2.7 胁迫处理下烟草NtTPP基因家族表达模式

为进一步探究基因的潜在功能，对15个基因在干旱和盐胁迫处理下的表达模式进行分析表明（图6、7），在干旱处理下，、、、、、、、和的表达量逐渐升高，并在6 h达到最高，其中，、和在6 h时表达倍数分别达到13、12和14倍，在1 h时表达量最高，但、和的表达量出现下降的趋势。除此之外，表达量呈现先上升再下降的趋势。干旱处理下有12个基因表达量呈现不同程度升高。

在盐胁迫处理下，、、和表达量均出现先升高再降低再升高的趋势，和表达量逐渐升高，并都在6 h时达到最高，表达倍数分别达到23和13倍，但和的表达量却出现下降的趋势。、、、、和在盐胁迫处理1 h时表达量最高，其中在1 h时表达倍数达到12倍，随后迅速下降。盐胁迫处理下有13个基因表达量呈现不同程度升高。

注：红色和绿色分别表示基因表达的上调和下调。

图6 普通烟草TPP基因家族在干旱处理下的表达模式分析

图7 普通烟草TPP基因家族在盐处理下表达模式分析

本研究在普通烟草基因组中鉴定得到15个基因，均含有TPP保守结构域。系统进化分析将其划分为3个亚家族，分别是CLASS Ⅰ、CLASS Ⅱ和CLASS Ⅲ，其中CLASS Ⅱ亚家族的、和与其他物种的TPP基因亲缘关系较远，说明它们在烟草中可能发挥特有的功能。进化分析发现烟草中没有亚家族CLASS Ⅳ成员，这与基因在拟南芥、水稻以及小麦中的进化不一致，表明CLASS Ⅳ亚家族成员可能在烟草长期的进化过程中丢失。对其基因结构和蛋白保守结构域的分析发现，同一亚家族内基因结构非常相似，Motif 1（TPP结构域）在所有的NtTPP基因家族成员中均有，Motif 11仅存在于CLASS Ⅲ亚家族，Motif 14仅存在于CLASS Ⅰ亚家族。对其启动子上的顺式作用元件分析表明，NtTPP基因家族成员包含大量与植物激素响应以及抗逆响应相关的顺式作用元件，进一步表明该基因家族在影响烟草生长发育及抗逆胁迫中扮演着重要的角色。

对烟草NtTPP基因家族转录组数据分析发现，NtTPP基因家族的大多数成员在低温和干旱胁迫条件下均有响应。前人研究发现过表达、和分别能提高拟南芥、水稻和玉米的耐旱性[11,14-15]；
过表达基因能提高拟南芥高盐胁迫耐受性[10]。我们进一步利用qRT-PCR对基因的表达模式进行验证，发现除和外，其他烟草NtTPP家族成员在干旱和盐胁迫诱导下表达量不同程度增加。其中、和在干旱胁迫下表达量增加较大，、和在盐胁迫下表达量增加较大。另外在干旱胁迫条件下表达量显著上调，该基因是拟南芥在烟草中的同源基因，先前的研究表明，可通过减少气孔开放和改善根系结构来提高拟南芥的抗旱能力[28]，在干旱条件下表达量上调暗示着该基因在烟草中也有相似功能。另外，在盐胁迫条件下转录水平也显著升高，表明该基因在烟草抵御逆境过程中有着重要作用。本研究通过NtTPP基因家族成员在非生物胁迫下的表达模式分析，初步鉴定一些抗逆基因、、、、、和，为研究其功能差异和提高栽培烟草的耐受性奠定基础。

本研究从普通烟草基因组中鉴定到15个TPP基因，划分为3个亚家族，分别为CLASS Ⅰ、CLASS Ⅱ和CLASS Ⅲ，均含有保守的TPP结构域。启动子分析发现大量与逆境响应有关的顺式作用元件存在于NtTPP家族成员的启动子上，并且大部分基因在根中的表达量较高，同时对干旱和盐胁迫均有响应，说明基因可能主要利用根部来提高烟草的抗逆能力，具体的作用机制还需要进一步在烟草中对该基因进行敲除以及过表达等方式来验证。

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Identification and Expression Pattern Analysis of the TPP Gene Family in Tobacco

LIU Tao1,2, GUO Cun3, ZOU Zongqing4, JIN Liquan5, WU Jian5, WEN Lichao1,2, DENG Zhichao1,2, CHU Yumeng1,2, WANG Lingtao6, LI Wei1*, GUO Yongfeng1*

(1. Key Laboratory of Tobacco Gene Resources, Institute of Tobacco Research of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Kunming Branch of Yunnan Provincial Tobacco Company, Kunming 650000, China; 4. Fujian Tobacco Company Longyan City Company, Longyan, Fujian 361000, China; 5. Shandong Linyi Tobacco Co., Ltd., Lanling Branch, Linyi, Shandong 277700, China; 6. Hubei Tobacco Company Shiyan City Company Zhuxi County Marketing Department, Shiyan, Hubei 442300, China)

Trehalose-6-phosphate phosphatase (TPP) is a key enzyme in trehalose metabolism and plays an important role in plant growth and abiotic stress response. In order to excavate members of the TPP gene family involved in tobacco development and stress response, we identified 15genes in the common tobacco genome through bioinformatic methods, with 7 of thegenes located on chromosomes. Phylogenetic analysis revealed that the newly identified tobacco TPP family members could be divided into three subfamilies: CLASS I, CLASS II and CLASS III. Syntenic analysis revealed that there were eight homologous gene pairs between Arabidopsis and tobacco. Sequence analysis showed that the promoters ofgenes contained various hormone- and stress-related elements. Furthermore, the expression ofgenes was studied in different tissues and most of thegenes were expressed at the highest level in roots. The expression pattern analysis showed that 12genes were up-regulated under drought stress, and 13genes could be induced by salt treatments. This indicates that thegene family members play an important role in drought and salt stress responses of tobacco.

tobacco; trehalose-6-phosphate phosphatase(TPP); drought stress; salt stress; expression pattern

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.001

S572.03

A

1007-5119（2022）06-0001-08

中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-TRIC02）

刘 涛（1998-），男，在读硕士研究生，研究方向：烟草育种。E-mail：2230928343@qq.com

，E-mail：李 伟，liwei06@caas.cn；
郭永峰，guoyongfeng@caas.cn

2022-06-07

2022-09-27

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