磁性大孔树脂对血红素吸附性能研究*

王 磊，孙 月，胡 宇，纪登杰，陈 丽

(1 江苏海洋大学药学院，江苏 连云港 222005；
2 江苏海洋大学江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222005；
3 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005)

血红素(heme)是由原卟啉 IX 与 Fe2 +结合而成，与珠蛋白结合成血红蛋白[1]，负责运输氧气，并在某些酶蛋白中作为电子传递反应的载体。血红素作为重要的生化药品，用于制备抗癌药血卟啉[2]、辅助治疗铅中毒和缺铁性贫血[3]，还可以用作发色剂及人工色素的替代品[4]，在食品与医药和化工等行业的应用颇多。

大孔树脂是一种利用分子间作用力进行吸附的非离子型多孔性高聚物吸附剂[5]，因其具有稳定、不溶解酸碱以及有机溶剂等特性，常被应用于有机化合物的分离和富集[6-9]。

磁性大孔树脂是利用无机磁性纳米颗粒以及高分子聚合物复合而成, 具有较好顺磁性能, 并具有良好分散性, 比表面积大的特点。

磁性大孔树脂是用无机磁性纳米颗粒与高分子聚合物复合而成，这种改性物质具有很好的顺磁性和较好分散性、比表面积大，可偶联生物分子容量大，生物相容性好，可以外加磁场吸引等特性，同时具有磁性材料和一般树脂的优点[10-13]。本论文制备了磁性大孔树脂，并比较了其与5种普通树脂对血红素的吸附性能，为血红素的进一步利用和功能开发提供基础。

1.1 材 料

实验试剂：血红素标准品；
FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、油酸、液体石蜡、无水乙醇、甲苯、span-80、过氧化苯甲酰、NaOH、苯乙烯、二乙烯苯、冰乙酸为分析纯。

大孔树脂：D101树脂、ASD60树脂、001*7树脂、201*7树脂、AB-8树脂，陕西领盛材料科技有限公司。

实验仪器：GZX-9240型电热恒温鼓风干燥箱烘箱;BS224S型电子分析天平;HH-6型恒温水浴锅;MR-96A型酶标仪;HZQ-X100型恒温振荡箱;JJ-1型机械搅拌器;DZF型真空干燥箱。

1.2 方 法

1.2.1 血红素标准曲线绘制

取适量的血红素标准品，在105 ℃烘干至恒重。精确称取2.0 mg，0.1 mol/L的NaOH溶液溶解并定容至100 mL。

分别量取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL血红素储备液，分别置于10 mL容量瓶内，用0.1 mol/L的NaOH定容至刻度，摇匀。以0.1 mol/L的NaOH为空白样，以385 nm处测的吸光值绘制标准曲线，标准曲线方程为y=0.0867x+0.0019，R2=0.9999。

1.2.2 磁性大孔树脂的制备

称取5.9 g FeCl3·6H2O和2.15 g FeCl2·4H2O溶解在200 mL去离子水中，通入N2保护，在80 ℃水浴下搅拌并加入NH3·H2O，调节pH至10，反应30 min后，加入4.5 mL油酸，得到改性的Fe3O4，用去离子水洗涤，于50 ℃真空干燥，保存备用[14-15]。

取500 mL三口烧瓶中，加入0.460 g过氧化苯甲酰和200 mL水，50 ℃水浴加热，并进行机械搅拌溶解，恒温20 min。将1.8 mL苯乙烯、1.8 mL二乙烯苯、26.8 mL甲苯和2.2 mL span-80置于烧杯中，超声使其分散均匀。将烧杯中的混合液加入到上述三口烧瓶中，并通入N2，于25 ℃水浴，缓缓滴加0.3 g的改性Fe3O4纳米颗粒，滴加完毕，温度升至75 ℃，恒温反应5 h后，冷却至室温，磁分离，使用无水乙醇洗涤3次，50 ℃真空干燥，得到磁性大孔树脂[16-17]。

1.2.3 大孔树脂预处理

各取适量5种大孔树脂置于烧杯中，分别用无水乙醇、5%NaOH和5%乙酸浸泡12 h，去离子水洗涤至中性，干燥备用。

1.2.4 血红素的吸附性能比较

准确称取预处理过的磁性大孔树脂和大孔树脂D101、ASD60、001*7、201*7和AB-8 1.0 g分别置于试管中，加入5 mg/L血红素溶液20 mL，在温度35 ℃、振荡速度150 r/min条件下进行反应，分别在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h时，采用磁分离，取上清液，测定血红素浓度。吸附率(%)计算公式如下：

式中：C0——血红素溶液初始浓度,mg/L

Ce——上清液中血红素浓度,mg/L

V0——初始溶液体积,L

V1——取完上清液后溶液剩余体积,L

1.2.5 磁性大孔树脂吸附血红素的条件研究

(1)不同浓度的血红素对吸附量的影响

称取0.2 g磁性大孔树脂置于锥形瓶中，分别加入浓度为2、4、6、8、10、12、15、20 mg/L的血红素60、30、20、15、12、10、8、6 mL，置于恒温振荡器，温度25 ℃、振荡速度150 r/min，6 h后取上清液，测定溶液中血红素含量，计算吸附量。吸附量(mg/g)计算公式如下：

式中：C0——初始血红素的浓度,mg/L

C1——吸附后上清液血红素的浓度,mg/L

V0——初始溶液体积,L

M——树脂质量,g

(2)不同反应时间对吸附量的影响

称取0.2 g磁性大孔树脂置于锥形瓶中，加入10 mL浓度为12 mg/L的血红素溶液，置于恒温振荡器，温度25 ℃、振荡速度150 r/min，分别在0.5、1、2、3、4 h，测定溶液中血红素含量，计算吸附量。

(3)不同反应温度对吸附量的影响

称取0.2 g磁性大孔树脂置于锥形瓶中，加入10 mL浓度为12 mg/L的血红素溶液，置于恒温振荡器，温度分别设置为15、25、35、45、55、65 ℃，振荡速度150 r/min，1.0 h后取上清液，测定溶液中血红素含量，计算吸附量。

1.2.6 响应面优化磁性大孔树脂吸附血红素

根据单因素实验结果，将料液浓度、反应温度、反应时间作为吸附考察的3个因素，采取每个因素3个水平，使用Design-Expert 8.0.6软件中响应面设计程序的Box-Behnken设计，产生17个试验。

2.1 吸附性能比较结果

6种树脂对血红素吸附性能进行比较，结果见图1。

图1 磁性大孔树脂和D101大孔树脂对血红素的静态吸附曲线Fig.1 The static adsorption curve of heme by magnetic macroporous resin and D101 macroporous resin

图1显示6种树脂对血红素的静态吸附总体趋势相同，吸附率随着时间的增长而逐渐增大，最后趋于稳定。磁性大孔树脂吸附率明显高于其他5种树脂，且在吸附1 h后即可达到吸附平衡状态，这表明磁性大孔树脂具有更强的吸附能力。

2.2 磁性大孔树脂吸附血红素的条件研究结果

2.2.1 不同浓度的血红素对吸附量的影响

图2 不同浓度的血红素对吸附量的影响Fig.2 The effect of different concentrations of heme on the adsorption capacity

图2表明在料液浓度小于12 mg/L时，吸附量随着料液料液浓度的增大而升高，料液浓度大于12 mg/L时，吸附量基本达到平衡，此时吸附量为0.5247 mg/g。这可能是由于样液浓度升高到一定程度，磁性大孔树脂表面接触到的血红素的量过多，从而影响血红素在树脂内部的扩散，导致吸附量有所下降。

2.2.2 不同反应时间对吸附量的影响

图3表明随着吸附时间的增加，吸附量在不断升高，当吸附时长达到1.0 h后，吸附量基本达到稳定，此时吸附量为0.5179 mg/g。

图3 不同反应时间对吸附量的影响Fig.3 The influence of different reaction time on the adsorption capacity

2.2.3 不同反应温度对吸附量的影响

图4表明随着温度升高，吸附量先增大后略微降低，在35 ℃时吸附量达到最大值为0.5389 mg/g，这可能是由于吸附达到了平衡，温度的升高会使吸附量略微下降。在低温条件下，短时间内吸附达不到平衡，而升高温度会使吸附速率加快，并出现吸附量增加的情况。

图4 不同反应温度对吸附量的影响Fig.4 The influence of different reaction temperatures on the adsorption capacity

2.3 响应面优化磁性大孔树脂吸附血红素

2.3.1 响应面数据分析

根据上述磁性大孔树脂对血红素的吸附的单因素实验，确定吸附条件优化因素水平见表1，采用响应面曲面法优化，方案及结果见表2。经多元拟合得到磁性大孔树脂吸附血红素的回归方程为：

Y=0.58+0.023A+0.018B+0.01C+(5.125×10-3)AB-(3.5×10-4)AC+(1.75×10-3)BC-0.033A2-0.034B2-0.049C2

使用响应面优化法研究各个影响因素对磁性大孔树脂吸附效果的影响，结合方差分析。

表1 磁性大孔树脂吸附条件优化因素水平Table 1 Optimization factor level of magnetic macroporous resin adsorption conditions

表2 磁性大孔树脂吸附优化试验表Table 2 Magnetic macroporous resin adsorption optimization test table

表3和表4是吸附量方差分析及回归方程可信度的结果。表3中的P值表示影响因素对模型的显著性，该回归模型的P<0.01，失拟项P>0.05，说明该模型的回归方程具有较高的拟合度，并且误差小，可以用来对不同吸附条件下吸附效果进行分析和预测。通过F值可以看出各因素的影响程度为：料液浓度(A)>反应温度(B)>反应时间(C)，即对吸附效果最有影响的因素是料液浓度，其次是反应温度，反应时间影响最小。

表4中拟合度R2是代表回归方程的可靠性，该值越接近1，方程的越可靠，该模型R2为0.9749，说明该模型回归方程可靠性较高。解释度R2adj是回归方程的校正后可以解释的响应值变化。回归方程信噪比(Adeq Precision)=14.481>4，表明该回归方程较好，完全有效。

表3 磁性大孔树脂吸附量响应面曲面方差分析表Table 3 Variance analysis table of response surface surface of magnetic macroporous resin adsorption capacity

表4 回归方程可信度Table 4 Reliability of regression equation

2.3.2 响应面模型分析

各个因素之间的交互作用响应面图如图5所示，从3D图可以看出随着反应温度、反应时间、料液浓度3个因素的增长，比吸附量出现先升高后下降的趋势，3D图出现陡峭，说明3个因素之间交互影响明显。

图5 交互作用的响应面图Fig.5 Response surface diagram of the interaction

2.3.3 模型验证

利用响应面软件分析得到最佳吸附条件为反应温度38.60 ℃、料液浓度10.76 mg/L、反应时间1.08 h，此时有最佳吸附量0.5891 mg/g。与单因素实验得出的反应温度35 ℃、料液浓度12 mg/L、反应时间1 h，最佳吸附量0.5326 mg/g，高出9.60%。为了验证试验的可行性，结合实验的客观可操作性，按照反应温度39 ℃、料液浓度11 mg/L、反应时间1.1 h进行3次平行试验，结果发现，血红素的吸附量在(0.5907±0.007)mg/g，与响应面模型预测结果基本相同。

该实验通过制备磁性大孔树脂，研究其对血红素的吸附性能。与5种普通树脂进行吸附性能对比发现：磁性大孔树脂吸附1.0 h达到平衡，吸附率为90.21%，吸附性能高于其他5种普通树脂。通过单因素和响应面优化结果来看，当反应温度在39 ℃、料液浓度为11 mg/L、反应时间为1.1 h时，磁性大孔树脂吸附血红素吸附量达到(0.5907±0.007)mg/g，与理论值误差为0.27%。

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