陇南油橄榄无糖果渣粉研制及安全评价

叶文斌，曹延龙，董 东，吴美丽，南旭阳，张 凯

(1.陇南师范高等专科学校 农林技术学院，甘肃 成县 742500；
2.陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃 成县742500；
3.甘肃省农业固体废弃物资源化利用重点实验室，甘肃 天水 741000)

油橄榄(Oleaeuropaea)是著名的木本油料植物[1]，而陇南地区是全国油橄榄主要的生长区，也是全国最大的油橄榄种植栽培和橄榄油加工产区[1-2].在油橄榄鲜榨过程中会产生40%左右的果渣[3-5]，这些果渣长期得不到有效的利用，造成了严重的资源浪费和环境污染[6-7].油橄榄果渣中含有羟基酪醇、齐墩果酸、没食子酸、原儿茶酸等多种活性物质[8-9]，具有抗菌消炎、降血糖、降血脂、抗人类免疫缺陷病毒、抗肿瘤、清除自由基等多种药理和生理功能[10-11]，具有开发为功能性食品的巨大潜力[12-14].另外，甘肃省陇南林区黄果槲寄生药源充足，黄果槲寄生果实多糖是其主要的生物活性物质和有效成分[15-16]，具有保肝和提高免疫力等多种生物功能[17-19].

随着甘肃陇南油橄榄种植面积不断扩大、产量不断增加，橄榄油加工废弃物也将大量产生.为了减少资源浪费和提高油橄榄果渣的再利用率，本文以陇南油橄榄果渣为研究对象，复配黄果槲寄生果实多糖，添加木糖醇、柠檬酸、氯化钙和D-异抗坏血酸钠等食品添加剂研制无糖果渣粉，并进行安全和保健功能评价，以期为陇南地区油橄榄加工废弃物的综合利用与黄果槲寄生果实多糖的深入研究提供参考.

1.1 实验材料与仪器

油橄榄新鲜果渣由陇南市经济林研究院提供；
小鼠(SPFKM)购自中国农业科学院兰州兽医研究所，许可证号为SCXK(甘)2020-0002；
黄果槲寄生果实多糖由陇南师范高等专科学校农林技术学院食品实验室提供，纯度为99.65%.主要的实验试剂有硫酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、无水乙醇、葡萄糖、苯酚、盐酸、芦丁、硝酸铝、亚硝酸钠、醋酸钾和石油醚等，均为分析纯；
木糖醇、柠檬酸、D-异抗坏血酸钠、氯化钙均为食品级.SOD、CAT、GSH-Px酶活性和MAD含量检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司.

主要的仪器设备有脂肪测定仪(上海新嘉电子有限公司，SZF-06A)、定氮仪(上海双旭电子有限公司，KDN-08D)、粗纤维测定仪(上海楚柏实验室设备有限公司，SLQ-6)、电感耦合等离子体发射光谱仪(美国热电公司)、氨基酸分析仪(德国SYKAM公司，S-433D)、紫外-可见分光光度计(成都安恒达科技有限公司，UV2800)、气相色谱仪(美国安捷伦公司，7890A)、冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-18N)、微量超细粉碎机(北京中科浩宇科技发展有限公司，FDV-SS)、高效液相色谱仪(日本岛津公司，Nexera LC-30A).

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程与要点 ① 工艺流程：陇南油橄榄果渣→烘干→过筛→粉碎→加入氯化钠溶液→添加黄果槲寄生果实多糖粉末→添加木糖醇→添加柠檬酸→添加氯化钙→添加D-异抗坏血酸钠→添加麦芽糊精→搅拌冷冻干燥→装瓶→封口→灭菌→冷却→包装.②工艺要点：将新鲜的陇南油橄榄果渣在50 ℃烘箱中干燥杀青，先过100目筛，后经超微粉碎6 000目过筛成粉；
添加0.1%的氯化钠溶液在摇床中摇晃10 min，搅拌均匀，添加黄果槲寄生果实多糖粉末在摇床中摇晃10 min，搅拌均匀；
再添加0.01%的氯化钙和0.03%的D-异抗坏血酸钠继续摇晃搅拌10 min，最后添加0.01%的麦芽糊精摇晃搅拌10 min；
待稳定后迅速冷冻干燥，脱气灭菌灌装后于室温阴凉干燥处保存.

1.2.2 陇南油橄榄无糖果渣粉单因素实验 将烘干过筛粉碎的陇南油橄榄果渣粉末，加入到用蒸馏水配制的质量浓度为0.10%的氯化钠溶液中，添加16%的木糖醇、0.18%的柠檬酸、0.25%的黄果槲寄生果实多糖、0.01%的氯化钙和0.03%的D-异抗坏血酸钠，开展无糖油橄榄果渣粉制备的单因素筛选.考虑果渣的颜色、光泽、粉质状态、溶解度、协效性和口感几个因素进行综合感官评定；
木糖醇的添加量以12%、14%、16%、18%和20%来进行筛选，在其他条件不变的情况下，柠檬酸的添加量以0.14%、0.16%、0.18%、0.20%和0.22%来进行筛选，黄果槲寄生果实多糖的添加量以0.15%、0.20%、0.25%、0.30%和0.35%来进行筛选.

1.3 感官综合评价与指标测定

1.3.1 感官综合评价 将制备好的无糖油橄榄果渣粉阴凉干燥放置7 d，邀请10名食品专业相关人员根据颜色、光泽、粉质状态、溶解度、协效性和口感进行综合感官评价，评价等级和标准参考李洪燕等[20]和蔡泓滢等[21]的方法并修改，感官评价标准如表1所示.

1.3.2 指标测定 依据国家标准，油橄榄果渣粉中水分含量采用GB 5009.3-2016中的干燥法测定，粗蛋白质含量测定采用GB 5009.5-2016中的凯氏定氮法测定，粗脂肪含量采用GB 50095-2010中的索氏抽提法测定，灰分采用GB 5009.4-20中的高温灼烧法测定，粗纤维含量采用GB/T 5009.10-2003中的重量法测定，果胶含量测定采用咔唑比色法，多糖含量采用苯酚硫酸法进行测定，矿物质含量测定采用电感耦合等离子体原子发射光谱法，多肽用双缩脲法测定，总砷按照GB/T 5009.11中的银盐法测定，总铅按照GB/T 5009.12中的石墨炉原子吸收光谱法测定，总镉按照GB/T 5009.15-2014中的石墨炉原子吸收光谱法测定，总汞按照GB/T 5009.17-2014中的原子荧光光谱分析法测定，商业无菌条件按GB/T 4789.26中的方法测定，霉菌计数按GB/T 4789.15-2003中附录A规定的方法测定，沙门氏菌按照GB 4789.4-2016中的方法测定，金黄色葡萄球菌按照GB 4789.10-2016中的方法测定.

表1 陇南油橄榄无糖果渣粉感官评价Tab.1 Sensory evaluation of candied fruit residue powder of Longnan olive

1.3.3 油橄榄无糖果渣粉对小鼠急慢性毒理实验 选取体重25～28 g的KM小鼠60只，适应性喂养7 d，后随机分为6组，每组10只，雌雄各半.采用最大耐受剂量法，先取30只小鼠分别灌胃制备好的果渣粉，将果渣粉配成溶液，分别以20 000、25 000和30 000 mg/kg体重标准空腹一次性灌胃；
后取10只小鼠以40 mL/kg体重标准灌胃生理盐水作为急性毒理对照，灌胃后观察其急性中毒症状、体征；
对所有小鼠正常供给饲料和水，连续观察7 d，检测急性LD50等生理指标.再取10只小鼠灌胃制备好的果渣粉溶液，以400 mg/kg体重标准空腹灌胃；
最后对剩余10只小鼠以5 mL/kg体重标准灌胃同等剂量的生理盐水作为慢性毒理对照；
所有小鼠连续灌胃90 d，饲料和水正常供给，观察其慢性中毒症状、体征及生活情况，检测90 d后的生理指标.小鼠急慢性毒理实验中血清SOD、CAT、GSH-Px酶活性和MAD含量全部用相应试剂盒中的方法检测.

1.4 数据统计与分析

实验数据均以平均数±标准差(x±s)表示，用 SPSS17.0 软件统计分析，并进行t检验，P<0.05表示显著性，P<0.01表示极显著性差异.

2.1 单因素实验与综合感官评价

木糖醇、柠檬酸和黄果槲寄生果实多糖添加量对陇南油橄榄无糖果渣粉的综合感官评价由图1所示.结果表明，在一定范围内，无糖果渣粉的综合感官评价分值随着3种食品添加剂的添加量升高而逐渐增加；
当木糖醇、柠檬酸和黄果槲寄生果实多糖的添加量分别为16% 、0.18%和0.25%时，果渣的综合感官评价分数

图1 不同添加量的木糖醇、柠檬酸和黄果槲寄生果实多糖对油橄榄无糖果渣粉感官品质的影响Fig.1 Effect ofxylitol,citric acil and Viscum coloratum fruit polysaccharides of different addition on sensory quality of olive sugar-free pomace

最高，分别达到了93.36分、94.85分和93.49分.木糖醇添加量为14%和18%、柠檬酸添加量为0.16%和0.20%、黄果槲寄生果实多糖添加量为0.30%和0.35%时，果渣的综合感官评价分数都有所降低.根据单因素实验分析，选择添加量为14%、16%和18%的木糖醇、0.16%、0.18%和0.20%的柠檬酸以及0.20%、0.25%和0.30%黄果槲寄生果实多糖做后续的响应面实验，来优化无糖果渣粉加工工艺.

表2 响应面中心组合实验设计工艺因素与水平Tab.2 Factors and levels of Box-Behnken design

2.2 油橄榄无糖果渣粉Box-Benhnken中心组合实验设计

选择油橄榄无糖果渣粉感官评价的单因素实验所确定的木糖醇添加量(A)、柠檬酸添加量(B)和黄果槲寄生果实多糖添加量(C)3个因素为自变量，以1、0、-1表示自变量的高低水平，以果渣粉的综合感官评分为响应值[22]，开展3因素3水平的Box-Benhnken中心组合实验设计，优化加工工艺.实验因素和水平见表2，响应面实验结果如表3和表4所示.

表3 油橄榄无糖果渣粉响应面实验设计及结果Tab.3 Technological Box-Behnken design and experimental results of olive sugar-free pomace

表4 油橄榄无糖果渣粉工艺条件响应面模型及方差分析Tab.4 Response surface and ANVOA analysis of olive sugar-free pomace

油橄榄无糖果渣粉响应面实验设计所涉及的3个因子的响应面回归模型方程为：

Y=92.38+4.29A-1.89B+1.55C-3.29AB+2.87AC-4.52BC-4.98A2-3.68B2-4.87C2.

表5 油橄榄无糖果渣粉营养成分和质量指标Tab.5 Nutritional composition quality index of olive sugar-free pomace

2.3指标测定

按照最佳优化工艺参数制备的油橄榄无糖果渣粉细腻均匀一致，香味协调风味独特.对果渣粉进行理化指标和微生物指标检测，结果如表5、表6所示.各项指标均符合果粉的国标要求，未检出致病菌，重金属含量<0.05mg/kg.

表6 油橄榄无糖果渣粉微生物指标Tab.6 Microbiological index of olive sugar-free pomace

在优化的配方中用木糖醇作为甜味剂，不但丰富了营养成分，还使产品适用于糖尿病患者[23-24]；
添加柠檬酸和D-异抗坏血酸钠，既可以增加立体的酸味感觉，又能提高保存时间，阻止氧化酸败，稳定产品的颜色[23-25]；
添加氯化钙可以强化果渣粉的均一性[23-26]；
添加黄果槲寄生果实多糖不但增添了产品的保健功能[13-14]，还能增添口感的层次性.

2.4 油橄榄无糖果渣对小鼠急慢性毒理实验

陇南油橄榄无糖果渣粉小鼠口服(灌胃)急性毒理实验中，按照表7所示剂量一次性灌服，灌胃后笼边观察7d，小鼠外观毛色正常，无窜动、扭体等异常反应，摄食和大小便均无异常，小鼠活动自如.7d后对小鼠

表7 油橄榄无糖果渣粉对小鼠急慢性毒理生理指标的影响Tab.7 Effects of olive sugar-free pomace on acute chronic toxicological and physiological indexes in mice

进行颈椎脱臼处死，进行重要脏器病理检查，没有出现明显病理变化.生理盐水对照组小鼠体重稍高于油橄榄无糖果渣粉灌胃组，但无显著性差异(P>0.05)；
生理盐水组小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量均稍低于油橄榄无糖果渣粉组.急性毒性实验中，除剂量30 000mg/kg的果渣粉组体重和生理盐水组小鼠相比有显著性差异之外，其余2组无糖果渣粉组(剂量20 000mg/kg和25 000mg/kg)体重与生理盐水组小鼠相比均无显著性差异(P>0.05)，说明油橄榄无糖果渣粉对小鼠体重和生化指标影响不大.根据毒理学评价标准，LD50>10 000mg/kg体重，属于急性无毒性物质.

慢性毒理实验中，小鼠灌胃90d后检测小鼠体重，发现2组小鼠体重都随着时间而增长，但生理盐水组小鼠体重均明显低于油橄榄无糖果渣粉组，而且二者之间存在极显著差异(P<0.01).经检测，生理盐水组小鼠血清中SOD、CAT和GSH-Px活性均低于油橄榄无糖果渣粉组，而且2组之间差异极显著(P<0.01)；
另外，检测发现生理盐水组小鼠体内血清中的MDA含量显著高于油橄榄无糖果渣粉组(P<0.01).结果说明油橄榄无糖果渣粉不但属于慢性无毒性物质，还具有一定的减小体重、提高抗氧化能力的作用.

以陇南油橄榄加工废弃物果渣为材料复配黄果槲寄生果实多糖，添加木糖醇、柠檬酸、氯化钙和D-异抗坏血酸钠等食品添加剂研制无糖果渣粉.根据感官评分，进行响应面设计实验；
结果表明优化配方是木糖醇、柠檬酸和黄果槲寄生果实多糖添加量分别为16%、0.18%和0.25%，同时添加0.01%的氯化钙和0.03%的D-异抗坏血酸钠.通过优化配方制备的油橄榄无糖果渣粉，实际测得感官评分与模型预测值相近；
经检测，重金属含量小于国家安全标准(<0.05mg/kg)，且未检出沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等致病菌，大肠杆菌数和真菌数量都远远低于国家安全标准.用制备的无糖果渣粉对小鼠一次性灌胃20 000、25 000和30 000mg/kg观察7d，并以400mg/kg标准连续灌胃小鼠90d，分别作为急慢性毒理实验.结果表明制备的无糖果渣粉无急慢性毒理作用，但有很好的抗氧化能力，还能有效降低小鼠体重，说明制备的产品具有一定的应用前景.

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