烟嘧磺隆降解菌株DT-4的降解特性及对高粱药害的缓解作用

张建华，曹昌林，郝佳丽，白文斌，曹 健

（1.山西农业大学高粱研究所/高粱遗传与种质创新山西省重点实验室，晋中 030600；
2.原平市农业农村局，原平 034100）

烟嘧磺隆（nicosulfuron）是日本石原产业株式会社发现，20世纪80年代末与美国杜邦公司联合开发的磺酰脲类内吸性除草剂，主要用于玉米田苗后一年生杂草的防除。因其具有活性高、选择性强、杀草谱广、田间使用量低等特性[1]，已成为中国北方玉米田用量最大的化学除草剂。随着烟嘧磺隆大规模使用，其所引起的残留问题日益突出，大量使用后所造成的残留叠加效应对整个环境的影响存在潜在的威胁[2-4]。

高粱具有光合效率高、生理优势强等多重抗性，可作为农田的边际和先锋作物，并可作为玉米的最佳轮作倒茬作物，在山西省的农业生产中具有巨大的发展空间和产业优势[5,6]。高粱是对除草剂比较敏感的作物，残存在土壤中的烟嘧磺隆可引起后茬高粱早期出现植株黄化矮小、叶片畸形、主根短等症状，且持续时间较长，严重的直接导致高粱死亡，成为制约玉米高粱轮作体系建立的重要制约因素[7]。目前，微生物已是农药降解最重要的手段，也成为科研研究的热点之一。前人关于烟嘧磺隆降解菌的研究多集中在降解微生物筛选和生物学特性[8-11]，降解效率较低导致实际应用研究较少。

微生物在生长过程中除了必须的营养元素外，环境条件对其生长和繁殖具有极其重要的影响，对降解效率及其应用潜力都具有显著的影响[12]。本研究在前期筛选鉴定的具有烟嘧磺隆高效降解能力的木霉属菌株DT-4的基础上，研究pH、温度、最适接种量及初始底物浓度等因子对其降解烟嘧磺隆的特性；
并采取盆栽实验生测与田间小区试验相结合的方法，深入研究DT-4修复作用对高粱生长发育的影响，探究降解菌不同剂型处理对喷施不同浓度烟嘧磺隆高粱在不同生长阶段的修复作用，以期为烟嘧磺隆污染环境的生物修复提供理论依据和菌株资源。

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 烟嘧磺隆降解菌株绿木霉DT-4保藏在山西农业大学高粱遗传与种质创新山西省重点实验室。

1.1.2 供试土壤 取自山西农业大学高粱研究所东白试验基地未施用过烟嘧磺隆的0～15 cm的土壤，pH为6.8，有机质含量为11.0 g/kg，除去残枝杂叶碎石等杂物，置于室温下通风处风干，过1 mm筛备用。

1.1.3 供试植物及药剂 高粱（晋糯3号，晋杂22号）；
4%烟嘧磺隆油悬浮剂（山东滨农科技有限公司生产），95%烟嘧磺隆原药（北京索莱宝科技有限公司提供）；
PDB液体培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1000 mL；
无机盐培养基：葡萄糖5.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 0.5 g，蒸馏水1000 mL。

1.1.4 供试仪器与设备 MGC-300A恒温光照培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
LDZF-50LL立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；
光合仪（美国LI-COR公司）；
FC-18台式高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；
UVmini1240型紫外-可见分光光度计（日本岛津株式会社）。

1.2 方法

1.2.1 烟嘧磺隆含量检测 施药后3、7、14、21、28 d分别采样，测定土壤中烟嘧磺隆的残留量，残留量检测方法参照张建华等方法[7]。

1.2.2 烟嘧磺隆降解菌生长量和降解率的测定 将菌株DT-4接种到PDB液体培养基中，培养48-72 h后取样调OD600值为1.0，作为种子液。按2%的接种量接入到50 mL的PDA培养基中，每个处理3次重复，于30 ℃、160 r/min摇床中培养72 h，每隔12 h取一次样，每次样品用无菌生理盐水稀释1倍，测菌体OD600值，确定烟嘧磺隆降解菌生长量。降解率测定是在其他条件不变情况下，加入烟嘧磺隆使其浓度为100 mg/L，按照1.2.1方法利用高效液相色谱质谱仪测定烟嘧磺隆残留浓度，统计分析算出降解率。

1.2.3 不同接种量、温度、pH值及初始底物浓度对降解菌生长量和烟嘧磺隆降解率的影响 在PDB液体培养基中设置接种量为1%、2%、4%、5%、6%，按5%的接种量设置温度为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，按5%的接种量用磷酸缓冲溶液调节初始pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，上述试验中每个处理加入100 mg/L的烟嘧磺隆；
按5%的接种量设置底物浓度为100、200、300、400和500 mg/L；
160 r/min振荡培养72 h后取样用无菌生理盐水稀释1倍后测定菌体OD600值，每个处理3次重复，按照1.2.1方法利用高效液相色谱质谱仪测定烟嘧磺隆残留浓度，统计分析算出降解率。

1.2.4 烟嘧磺隆降解菌生物修复对高粱生长发育及生理指标影响 取过2 mm筛未施烟嘧磺隆的土壤，配制成含0.075 mg/kg烟嘧磺隆土样，调节土壤含水量为田间最大持水量的30%，按10 mL/kg（1×109cfu/mL）接种量向土壤中添加DT-4种子液，设3次重复，另设空白对照、药剂对照处理，每个处理均以1 kg标准土样平均装入3个洁净的培养钵中。将营养钵放入人工气候培养箱中培养，昼夜温度分别为25 ℃、22 ℃；
光照培养8 h、黑暗16 h。观察高粱的生长发育情况，在出苗后6、8、10、12和15 d取样测量株高，10、12和15 d取样测定根长、鲜重。根据文献[8]于高粱三叶期测定根系活力，根据文献[13]方法测叶绿素含量，并在取样当天9:00—11:00利用美国LI-COR公司光合分析仪测定光合速率。

1.2.5 不同剂型降解菌剂田间土壤修复作用及对高粱生长和产量的影响 试验地点在山西农业大学高粱研究所东白试验基地，试验田土壤为壤土，试验地上年种植高粱，未使用烟嘧磺隆，随机区组试验设计，试验共15个处理，每处理设置3次重复，小区面积为180 m2，播种前7 d分别按30、60和120 g a.i./hm2的量喷施烟嘧磺隆，2021年5月播种高粱。试验前制作烟嘧磺隆降解菌粉剂（2×108cfu/g），按50 kg/（667 m2）剂量施用，菌液（2 ×108cfu/mL）处理按照50 L/667 m2的剂量施用，于播种时一次性施用，解毒剂（碧护）在高粱三叶期按150 mL/667 m2的剂量喷施。同时设置药剂对照和空白对照。在高粱生长的苗期、拔节期和抽穗期进行取样，在烟嘧磺隆量为60 g a.i./hm2小区内分别随机取高粱10株测定高粱株高，于2021年10月收获时测定各试验小区高粱产量。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0软件对数据进行处理，应用邓肯氏新复极差法进行差异显著性检验。

2.1 烟嘧磺隆标准曲线

烟嘧磺隆标准曲线如图1所示，烟嘧磺隆浓度在0.0025～0.1 µg/mL范围内，峰面积与烟嘧磺隆浓度之间的线性关系良好，R2为0.9997，符合农药残留分析的要求。

图1 烟嘧磺隆标准曲线Fig.1 The standard working curve of nicosulfuron

2.2 烟嘧磺隆降解菌生长量和降解率的测定

由图2 可知，菌株DT-4对烟嘧磺隆的降解与菌体的生长呈正相关。培养0～40 h，DT-4生长量缓慢增长；
培养40～80 h，DT-4生长量达到对数增长期；
培养100 h菌体生长量值达到最大，处于稳定生长期；
培养120 h后菌体开始进入衰亡期；
降解率随降解菌生长量的增加而显著增加，培养80 h降解率为85.69%，培养100 h接近93.00%（图2）。

图2 降解菌生长量和烟嘧磺隆降解率随时间的变化趋势Fig.2 The growth trend of the nicosulfuron-degrading bacteria and the degradation rate of nicosulfuron with time

2.3 不同接种量、温度、pH值及初始底物浓度对降解菌生长量和烟嘧磺隆降解率的影响

由图3可以看出，随着接种量增大，菌株DT-4 对烟嘧磺隆降解效率明显增加，DT-4降解烟嘧磺隆适宜接种量范围为2%～5%，最适接种量为5%（图3A）；
在20 ℃～40 ℃范围内，随着温度升高，菌株DT-4生长量和烟嘧磺隆降解率显著提高，35 ℃时生长量达最高，降解率达到最大值92.64%（图3B）；
pH在5～9范围内，菌株最适pH生长范围为5～8，pH 5.0时达最大值（图3C）；
烟嘧磺隆初始质量浓度对菌株生长影响较大，浓度在100～200 mg/L时菌株生长良好，浓度高于300 mg/L生长量显著下降；
烟嘧磺隆初始质量浓度低于200 mg/L 时，菌株对烟嘧磺隆的降解率随其初始浓度增加而增高，当烟嘧磺隆质量浓度为200 mg/L时，菌株对烟嘧磺隆降解率最大，达到93.85%，当烟嘧磺隆初始浓度继续增加时，菌株对烟嘧磺隆降解率随其浓度的增加而降低，这可能是由于高浓度烟嘧磺隆对菌株生长产生抑制，活性降低而减少对烟嘧磺隆的降解利用（图3D）。

图3 降解菌最佳生长条件曲线Fig.3 The curves of optimal conditions for growth of the nicosulfuron -degrading bacteria

2.4 烟嘧磺隆降解菌生物修复对高粱生长发育及生理指标影响

2.4.1 降解菌的修复作用对高粱生长指标的影响 由图4可知，烟嘧磺隆残留浓度为0.075 mg/kg时，对高粱株高、根长、鲜重均有明显抑制作用，且抑制率随胁迫时间的增加而增大。烟嘧磺隆胁迫15 d后，对高粱株高抑制率高达63.43%，在烟嘧磺隆土壤中加入DT-4降解菌后，高粱受害情况明显减轻，株高、根长、鲜重均明显高于药剂对照，菌液处理与药剂对照差异显著（P＜0.05），与空白对照差异不显著（P＞0.05），能够将烟嘧磺隆残留对高粱药害完全缓解（图4A）。烟嘧磺隆残留对高粱根长的最大抑制率出现在胁迫后10 d，高达70.37%。在烟嘧磺隆土壤中加入DT-4降解菌后，高粱根长的受害情况大幅减轻，施用菌剂10、12、15 d后与空白对照差异均不显著（P＞0.05）（图4B）。烟嘧磺隆残留对高粱鲜重的最大抑制率出现在胁迫后12 d，高达71.91%，DT-4降解菌明显缓解高粱鲜重受害情况，施用菌剂12、15 d后与空白对照差异均不显著（P＞0.05），但显著高于药剂对照（P＜0.05）（图4C）。

图4 降解菌的修复作用对高粱生长指标的影响Fig.4 The repairing effect of nicosulfuron -degrading bacteria on sorghum growth index

2.4.2 降解菌的修复作用对高粱叶绿素和根系活力的影响 由图 5可以看出，烟嘧磺隆残留浓度为 0.075 mg/kg时，对高粱的叶绿素含量和根系活力均具有明显的抑制作用，抑制率分别高达 60.16%和 58.70%。在烟嘧磺隆土壤中加入DT-4降解菌剂后，高粱的叶绿素含量和根系活力受害情况均明显缓解，与药剂对照差异显著（P＜0.05）。

图5 施用降解菌对高粱叶绿素和根系活力的影响Fig.5 Effects of nicosulfuron-degrading bacteria and antidote applied on chlorophyll and root vitality of sorghum

2.4.3 降解菌的修复作用对高粱净光合速率的影响 由表1可以看出，烟嘧磺隆残留浓度为0.075 mg/kg时，对高粱的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率的抑制率分别为25.80%、41.89%、27.78%。使用DT-4降解菌剂后，高粱的净光合速率等光合指标缓解明显，与药剂对照差异显著（P＜0.05）；
高粱受到烟嘧磺隆胁迫后胞间CO2浓度显著升高，施用降解菌剂后其含量明显下降。

表1 施用降解菌及解毒剂对高粱净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率的影响Table 1 Effect of nicosulfuron -degrading bacteria and antidote applied on the net photosynthetic rate, stomatal conductance, intercellular CO2 concentration and transpiration rate of sorghum

2.5 不同剂型降解菌剂田间土壤修复作用及对高粱生长和产量的影响

由图6可知，降解菌剂对喷施60 g a.i./hm2烟嘧磺隆后残留土壤中高粱的生长有较好促进作用。高粱苗期，降解菌剂处理和解毒剂处理高粱株高与药剂对照相比，差异均不显著（P＞0.05）；
随着高粱生长，不同处理差异显著增加，拔节期菌液、粉剂和解毒剂处理高粱株高均显著高于药剂对照，分别高48.57%、70.65%和54.29%，但与空白对照相比差异仍显著（P＜0.05）；
抽穗期菌液、粉剂和解毒剂处理高粱平均株高分别为157.3、170.1和161.6 cm，与拔节期相同均显著高于药剂对照，且与空白对照相比差异不显著（P＞0.05）；
拔节期和抽穗期均表明，粉剂处理与另外两种处理相比差异均显著（P＜0.05），菌液和解毒剂处理差异不显著（P＞0.05）。

图6 施用不同剂型降解菌剂及解毒剂对高粱株高的影响Fig.6 Effect of nicosulfuron -degrading bacteria and antidote applied on the height of sorghum

由表2可知，喷施烟嘧磺隆导致高粱穗长、一级枝梗数、成穗率、千粒重及产量下降。使用烟嘧磺隆降解菌剂后，可以有效减轻高粱药害，对高粱成穗率、千粒重及产量等均具有恢复作用。烟嘧磺隆使用剂量为30 g a.i./hm2时，药剂处理对高粱产量有一定影响，但差异不显著（P＞0.05）；
粉剂与菌液、解毒剂处理均可以使高粱产量基本恢复至对照水平，但处理间差异不显著（P＞0.05）。烟嘧磺隆使用剂量为60 g a.i./hm2时，药剂处理对高粱产量有差异极显著影响（P＜0.01）；
粉剂与菌液、解毒剂处理均可以大幅提高高粱产量至无明显药害水平，与药剂处理相比差异极显著（P＜0.01），且粉剂处理明显好于菌液与解毒剂处理，产量分别提高1.1%和2.0%；
烟嘧磺隆使用剂量为120 g a.i./hm2时，菌剂与解毒剂处理对高粱药害的缓解作用均较差，菌液和粉剂处理与空白和药剂对照相比均差异显著（P＜0.05），且粉剂与菌液处理间差异显著（P＜0.05），解毒剂与菌液处理间差异不显著（P＞0.05）。结果表明，烟嘧磺隆降解菌剂应用效果为粉剂处理＞菌液处理。

表2 施用不同剂型降解菌剂及解毒剂对烟嘧磺隆污染土壤中高粱产量性状的影响Table 2 Effects of nicosulfuron-degrading bacteria and antidote applied on the yield traits of sorghum

关于烟嘧磺隆除草剂的微生物降解已有相关研究，Lu等[14]分离到一株米曲霉Aspergillus oryzae，在烟嘧磺隆浓度为2 mg/L 的条件下降解率可达98.8%；
Zhang等[15]报道了一株沙雷世菌SerratiaN80，可在96 h内降解浓度为10 mg/L的烟嘧磺隆 93.6%；
Lu等[16]从农药厂污水中分离得到降解菌株枯草芽胞杆菌BacillussubtilisYB1和黑曲霉Aspergillus nigerYF1，经过5 d连续培养可对2 mg/L烟嘧磺隆的降解率分别达到78.1%和80.3%。本研究获得的菌株DT-4能够在100 h内对浓度为100 mg/L烟嘧磺隆降解率达到93.00%，降解效率高于齐萌[17]、谭佳丽[18]、代鹏飞等[19]、王振海[20]、周珊[21]研究，其修复作用可以使喷施烟嘧磺隆浓度低于60 g a.i./hm2残留土壤中高粱的生长发育指标基本恢复至对照水平，明显降低了烟嘧磺隆残留药害，表明菌株DT-4是一株性能优良的烟嘧磺隆降解菌株。

目前，通过富集、筛选、驯化等手段，科研工作者从土壤、农药污水处理池的活性淤泥及废水等受磺酰脲类除草剂污染的环境介质中，分离出了多种可降解烟嘧磺隆的微生物。已分离到的细菌包括假单胞菌属Pseudomonas、芽胞杆菌属Bacillus、微球菌属Micrococcus及产碱杆菌属Alcaligenes等；
已分离到的真菌种类主要有青霉属Penicillium、曲霉属Aspergillus和篮状菌属Talaromyces等[22-24]。本研究中发现的DT-4菌株，经形态学、生理生化、ITS序列分析鉴定，该菌株为木霉属绿木霉，与前人文献比对分析，确定该木霉属菌株在降解烟嘧磺隆方面鲜有报道，进一步拓宽了烟嘧磺隆降解微生物菌种资源。

本研究中降解菌剂型应用效果为粉剂＞菌液处理，可能原因是与液态微生物菌剂相比，固态制剂在施用到土壤后受到载体等物质保护不易失活，从而提高了降解效率，这与郭静等[25]对微生物菌剂制备的结论一致。

本文报道的木霉属菌株绿霉菌DT-4能够高效降解烟嘧磺隆，且该菌株处理100 mg/L烟嘧磺隆80 h后降解率为85.69%，100 h接近93.00%，通过单因素法明确了该菌株最佳降解条件为培养温度35 ℃、pH 5、最适接种量5%、烟嘧磺隆初始质量浓度200 mg/L。采用降解菌DT-4处理烟嘧磺隆残留土壤后，可显著降低减轻烟嘧磺隆残留对高粱生长发育的抑制作用，对株高、根长和株鲜重均有明显恢复作用。降解菌生物修复作用在高粱抽穗期最为明显，对烟嘧磺隆使用剂量低于60 g a.i./hm2土壤中高粱产量有明显恢复作用，且降解菌剂型应用效果为粉剂＞菌液，为今后降解菌剂型制备提供可行思路，具有潜在应用价值。降解菌DT-4与土壤环境微生物相互作用、能否在高粱根际定殖及降解机理仍有待于进一步研究。

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