东方蝾螈脊髓损伤模型的建立及其评价

王 迪 赵 曼 陈 杰 汤 枭 李 君

(1.安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241000；
2.芜湖第二人民医院，安徽 芜湖 241000)

脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)是一种在医学上至今仍然不能被治愈的疾病，脊髓损伤后会使机体自损伤节段以下的部位失去感觉和运动功能，给人类身心带来极大的痛苦.因此，实现人类脊髓损伤的再生修复是再生医学领域科学家的追求.而自然界中有一些生物的再生能力则令人叹服，比如涡虫[1]、斑马鱼[2]、壁虎[3]、蝌蚪[4]、蝾螈[5]等.

东方蝾螈(Cynopsorientalis)，也称中国火龙，是两栖动物有尾目蝾螈科的一种.它能在四肢[6]、尾部[7]、视网膜[8]、颌骨[9]、心脏[10]、脊髓[11]受损后实现再生，正是由于它的这种独特的再生能力而成为发育生物学、再生生物学领域的良好模式生物.它能实现脊髓的轴突和神经元再生，重塑中枢神经系统，让机体恢复感觉和运动功能.东方蝾螈脊髓损伤模型的成功构建将为SCI后轴突再生和神经再生研究提供一种有价值的动物模型，为我们了解东方蝾螈SCI再生的细胞和分子机制奠定基础，进而为人类的SCI治疗提供新思路.

如今，对SCI再生研究的动物模型构建鲜有全面的报道，很多不同的损伤模型都被用来研究脊髓再生，其中最主要的两种模型是尾部截断和脊髓横断[12].尾部截断是单极损伤，脊髓将向尖端再生，其中包含了脊髓、骨骼肌、脊索、血管和皮肤的再生；
而脊髓横断是双极损伤，头端和尾端都延伸到间隙并最终重新连接，主要是启动神经束的再生[13].脊髓横断有两个主要位置，分别位于胸椎节段和尾部节段.在胸椎节段会导致后肢瘫痪，可以模拟出人类遭受车祸或者疾病造成脊髓损伤的症状，且可根据其行为学表现判断恢复情况.早期Piatt[14]就通过横断分别处于胚胎、幼体和成体这三种不同年龄阶段东方蝾螈的主干脊髓，发现在发育的所有阶段，脊髓在解剖学和功能上都能再生，而成体需要更长的时间才能再生.本文将围绕10月龄幼体东方蝾螈进行脊髓胸部水平横断的方法进行探讨，并对损伤后的动物进行运动评分，为SCI再生的研究提供重要的动物模型.

1.1 实验动物与分组

实验所用东方蝾螈均购买自湖北武汉地区，饲养于22 ℃±3 ℃的玻璃水族箱中，水系统pH值保持在7.2～7.4，并给其提供水陆两栖的生活环境，每天换水一次，投虫干喂养，提供14 h白昼和10 h黑夜的光照周期，适应一周.挑选体重为1.5 g～2 g健康东方蝾螈，雌雄不限，随机分成两组，模型组20只，采用脊髓横断术进行脊髓损伤模型构建；
假手术组20只，只进行椎板移除，不横断脊髓.各组分别于术后不同时间点进行行为学评分，直至实验组恢复游泳能力.所有实验均经安徽师范大学生命科学学院伦理与动物关爱与使用委员会批准.

1.2 脊髓损伤模型建立

将东方蝾螈放在质量分数为0.05%的三卡因溶液(pH=7.2～7.4)中，麻醉10 min～15 min，见动物不再游动且身体触摸无反射时将动物取出，俯卧于解剖盘中，使它的躯干区域稍微支撑起来.在它的头部和尾部上盖上湿润的海绵，用体积分数为75%酒精轻轻擦拭皮肤，用无菌的13号囊膜剪对东方蝾螈脊椎T7～T9棘突处(背侧前后肢1/2位置)脊椎骨进行脊髓横断，建立脊髓损伤模型，肌肉和椎骨做一个横向深切口，露出脊髓，横断脊髓，如图1.用无菌PBS冲洗伤口的血液，再用手术镊闭合伤口，在伤口滴加适量的医用组织胶水，并在冰上静置10 min左右.转移到玻璃水族箱中恢复，恢复期间使用脱氯水.手术结束后约20 min即可醒来，待动物苏醒后将其放在平面上爬行，以后肢完全没有辅助力量、自然拖动前行作为建模成功的标准.假手术组作为对照，即在其他操作一致的前提下对脊髓只进行暴露，不进行横断.

图1 东方蝾螈脊髓损伤模型的建立

1.3 术后护理

将两组实验动物分别放在饲养条件相同的两个水族箱中，使用含有抗菌素的脱氯水饲养，前三天置于避光环境中恢复且不喂养食物，防止污染水质造成伤口感染.从第四天开始置于正常光照中且开始喂食物.

1.4 SCI模型组和对照组影像学检测

脊髓损伤后即刻需要在低温环境下迅速取出受损的脊髓组织，选择的取材位置及尺寸为东方蝾螈背部损伤位点的上、下各4 mm，共8 mm左右，且包含椎骨，用体积分数为4%多聚甲醛固定液固定标本24 h以上，后用脱钙液脱钙40天，前三次每五天换一次脱钙液，而后每日更换，脱钙结束后使用梯度酒精组(体积分数分别为75%、85%、90%、95%、100%的酒精)进行脱水，后用二甲苯透明，石蜡包埋，最后使用厚度4 μm的石蜡切片，进行Hematoxylin-Eosin(苏木精-伊红)染色法染色，以正常东方蝾螈作为对照，在光学显微镜下观察并拍照记录.

1.5 运动功能评价

对模型组和假手术组的后肢运动情况进行评分，根据东方蝾螈在陆上爬行和水中游泳情况，对两组动物手术前与术后不同时间点(2 d、4 d、7 d、14 d、21 d，用0 d表示手术后立即测试的结果)后肢的运动和游泳功能恢复情况进行评估.将东方蝾螈置于1 m×1 m的正方形水平湿润矿场内，充分适应环境后，观察其后肢反射、尾部反射、后肢爬行协调能力、脚掌着地情况、五分钟内爬行距离.将东方蝾螈置于15 cm×30 cm的鱼缸中，盛满1/2的饲养用脱氯水，充分适应环境后观察其后肢辅助游泳情况，三人同时对运动行为进行评分，评分标准见表1，汇总评分结果，求其平均值作图分析.

表1 东方蝾螈后肢运动情况评分表

1.6 统计学分析

两组实验动物的运动功能评价结果用均数±标准误差表示，用SPSS19.0软件包进行统计学分析处理，组间比较采用t检验，组内两两比较采用SNK-q检验.以P<0.05表示差异具有统计学意义.

2.1 术后动物一般情况观察

术后短期内动物运动量明显减少，喜陆栖，对一直在爬台上的蝾螈要在每次换水时将其放入水中自由游动，否则会因在空气中时间太长导致皮肤干涸而死.术后模型组出现明显的双后肢瘫痪，尾部无辅助力量，仅能靠前肢艰难活动，对照组则运动功能正常.所有蝾螈伤口恢复期间无出血，无感染，恢复良好，与预期相符.

2.2 建模成功影像学结果

从形态学染色可以看出，正常东方蝾螈的脊髓矢状切片中，中央管周围的室管膜细胞排列整齐，形态完整(如图2A)，脊髓损伤手术处理后即刻的组织切片可见明显切口(如图2B)，脊髓腔中的细胞排列遭到严重破坏，脊髓前后断连，表现为脊髓横断状态，与行为学结果一致，表明建模成功.

图2 东方蝾螈脊髓损伤建模对比图

2.3 行为学评分结果

在0 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d对两组动物的后肢运动、游泳、感觉和反射功能进行行为学评分，结果如表2和图3所示.发现SCI模型组动物评分整体呈上升趋势，对照组呈不变趋势，在0 d、2 d、4 d、7 d、14 d时模型组和对照组有极显著差异(P<0.001)，在21 d时相比有较显著差异(P<0.01).此结果说明了模型组动物的后肢运动和感觉功能在恢复，东方蝾螈具有脊髓再生修复的能力，是研究脊髓损伤再生的良好动物模型.

表2 两组动物在不同时间点运动功能评分的比较

图3 东方蝾螈脊髓损伤后运动功能评分

2.4 模型组和对照组的影像学结果

根据行为学的结果，选择脊髓损伤后4天和10天的时间点进行脊髓组织冠状切片染色处理，观察受损脊髓恢复的程度.根据苏木精-伊红染色结果可知(图4)，SCI处理后4天仍可看到脊髓中细胞排列结构仍处于被破坏状态，室管膜胶质细胞和神经细胞散乱，脊髓中出现细胞空洞，散落在脊髓腔周围.但随着蝾螈自主恢复的进行，脊髓损伤后10天细胞逐渐恢复规则排列，被破坏的组织结构也逐渐还原.室管膜细胞和神经细胞基本规则排列，对应行为学评分出现明显好转，但仍存在大量的细胞空洞，并未完全恢复.

图4 脊髓损伤不同时刻的横切HE染色结果图

从19世纪50年代，人们就开展了针对脊髓再生的研究，近些年来，很多具备脊髓再生能力的动物就成了再生生物学领域的模式生物，而关于动物模型的建立方法则鲜有报道.东方蝾螈具有在尾部截肢、脊髓半切、脊髓完全横断、脊髓挤压损伤后再生脊髓的能力，且这种能力贯穿一生[15].Piatt曾对五个不同发育时期的蝾螈进行脊髓横断后175天的恢复情况观察，发现均能实现完全再生，且年龄越小越快恢复[14].本文使用10月龄幼体东方蝾螈进行脊髓完全横断实验，此方法的优点在于：(1)再生速度快，有效缩短实验周期；
(2)实验动物造价低，容易获得；
(3)实验有很好的可重复性和可操作性，易于在相同的条件控制.该模型有一定的局限性，东方蝾螈体型小，应谨慎操作，且开口不可过大，否则容易感染致死，其次，东方蝾螈椎骨坚硬且厚实，脊髓细且脆弱，要细心操作.

Piatt的研究发现在幼体蝾螈中，脊髓损伤的头端和尾端仅需7天即可发生解剖学上的重连，也有研究者通过组织学技术发现在脊髓再生期的第7天，室管膜发生部分连续，在横断区至少在脊髓一侧可见轴索；
在再生期第28天，室管膜上皮和管腔几乎已正常连续，且轴索重建[12].这与本实验行为学结果相符合.期待此动物模型能为东方蝾螈脊髓损伤再生的分子细胞机制研究提供基础，找到哺乳动物无法再生的原因，进而为实现人类脊髓损伤的再生医学实践谋福音.

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