STIM1,基因在人下咽癌细胞系FaDu,中的表达及对细胞凋亡的影响分析

孙源昊，李文龙，代兵，于慧媛，常江

深圳市萨米医疗中心，广东深圳 518118

下咽癌是原发于下咽部的恶性肿瘤，其形成于喉咙底部组织，且95%以上为鳞状细胞癌，患病部位从高到低依次为梨状窝、环后区、咽后壁3 处[1]。国外调查数据显示，美国每年3 000 人被确诊为下咽癌，男性患病率为女性患病率的5 倍，且患病早期无明显症状，随病情加重患者咽喉部出现声嘶、颈部肿块、贫血、消瘦等临床表现，肿瘤侵犯颈部血管还可造成严重病质表现，影响患者生存质量[2-3]。钙离子通路与癌症关系密切，相关研究证实，通过抑制钙离子可促使癌细胞生长停滞并诱导细胞凋亡，而调控细胞质内钙离子的整个过程被称为内质网钙库调控的胞外钙离子内流进程（store-operated calcium entry, SOCE）[4-5]。STIM1 基因是SOCE 输入过程中的关键基质，对癌症细胞调控生长生存尤为重要，相关研究表明STIM1 是致癌基因，其在食管癌、宫颈癌中高表达[6-7]。但当前尚无确切研究证实STIM1 在下咽癌中表达情况及生物学水平变化。基于此，本文选取2020 年3 月—2022 年3 月期间深圳市萨米医疗中心耳鼻咽喉科收取的40 份咽癌患者细胞作为培养对象，着重分析STIM1 在人下咽癌FaDu 细胞中的表达及凋亡情况，现报道如下。

1.1 一般资料

选取于本院就诊的40 份下咽癌患者细胞作为培养对象，通过培养人下咽癌细胞系FaDu 细胞，分为两组，各20 份。

1.2 诊断标准

经常规X 线检查后梨状窝密度增高、椎前软组织明混增厚，气管推向前，声带及室带变形。

1.3 纳入与排除标准

纳入标准：①培养对象符合下咽癌诊断标准；
②研究对象细胞符合《2016 英国国家多学科指南：下咽癌》诊断标准[8]；
③培养基符合《中国药典》2010版和《哺乳类动物细胞培养基》（HG/T 3935-2007）标准[9]。

排除标准：①培养对象资料不完整；
②细菌数＜200；
③细胞数量培养72 h 后低于1×108cells/mL；
④细胞形态变异。

1.4 方法

①培养基：首先进行细胞培养，选取定量培养基，通过液氮对下咽癌FaDu 细胞进行迅速解冻，并在离心后去上层清液，将培养液放入含有青链霉素和胎牛血清的培养基中，置于37℃、5% 二氧化碳中。

②慢病毒感染：对生长发育的细胞混悬液进行慢病毒感染，将生成混悬液置入6 孔板内，放置于37℃、5%的二氧化碳中，直至细胞融合度＞30%，根据细胞原始数据适当添加病毒，12 h 后观察评估细胞状态，若细胞未出现明显毒性作用，需进行二次培养，时间延长至24 h 后更换培养基，若细胞出现毒性作用，应及时更换培养基，感染3 d 后观察培养基基因表达情况，细胞感染后进行详细记录。

③细胞增殖：对照组为常规空白组，添加适量BrdU，且实验时无须加入，检测前加入试剂，以1:100 比例进行稀释，稀释后适量添加试剂进行培养。

④细胞凋亡：采用D-Hanks 对细胞进行单次冲洗，并对细胞进行胰酶消化，培养上清终止消化，收集细胞后存于离心管内，各组设定3 个复孔，采用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline, PBS）进行冲洗沉淀离心，离心后收集细胞，添加5μl annexin V-APC 染色，基于常规温度下避开阳光照射，10 min 后转移到流式上机管中，进行测验。

⑤细胞周期：细胞发育到80%时吸附舍弃细胞培养上清，并对细胞进行冲洗，经胰酶消化细胞后停止培养，并将细胞放置于离心管内设置复孔，离心后舍弃上清并应用乙醇进行细胞固定，固定后离心处理固定液，对细胞再次进行冲洗沉淀，确保上机细胞通过率达到240 cell/s，将300 目细胞过滤筛网转移至上机管内进行上机测试。

⑥细胞蛋白水平：对两组培养基加入提前预冷的裂解液，在冰上裂解30 min，裂解后用超声破碎细胞，4℃ 12 000 r/min 低温高速离心15 min，弃沉淀，取上清，应用Western blot 相关总蛋白分析试剂测量562 nm 处的吸光度，并作蛋白标准物的吸光度-浓度曲线，对测得结果进行比较。

1.5 观察指标

比较两组病毒感染后蛋白水平表达及细胞凋亡、增殖、生长能力情况。

1.6 统计方法

采用SPSS 22.0 统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间差异比较进行t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 两组细胞蛋白水平表达比较

STIM1 组蛋白水平表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组细胞蛋白水平表达对比(±s)

表1 两组细胞蛋白水平表达对比(±s)

2.2 两组细胞凋亡、增殖、周期比较

STIM1 组细胞凋亡、增殖情况高于对照组，周期情况低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组细胞凋亡、增殖、周期对比[(±s),%]

表2 两组细胞凋亡、增殖、周期对比[(±s),%]

2.3 两组细胞数及细胞增殖倍数比较

STIM1 组细胞数高于对照组，增殖倍数低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组细胞数及细胞增殖倍数对比(±s)

表3 两组细胞数及细胞增殖倍数对比(±s)

人下咽癌在临床癌症中发病率较低，但在头颈肿瘤发病率中占据5%，且恶性程度较高，发病位置较为特殊，70%下咽癌患者确诊时已为晚期，治疗后预后效果欠佳[10]。国外针对下咽癌以手术和放疗为主，早期下咽癌主要以根治性放疗治疗为主，在治疗过程中患者生存率与根治性手术无差异，于20 世纪中期放疗是治疗下咽癌的主要手段，但随医疗技术不断发展，手术序贯放疗治疗出现，但当前多数下咽癌患者就诊时已进展至中晚期，需给予手术放疗综合治疗[11]。当前国内针对下咽癌治疗主要采取综合治疗方式，早期患者可经口微创外科切除或进行颈部清扫，包括对T1N0以及选择性的T2N0 患者进行保喉手术；
对T1～3N0～3 和T4aN0～3 无器官功能保留需要的患者行全喉切除术；
对T1～3N0～3 和T4aN0～3 在行诱导化疗后原发灶小于PR 者，行手术治疗；
对行根治性放化疗后残存或复发的患者进行手术治疗[12]。对于需要保留喉功能的患者，多行手术联合颈部清扫，并进行放疗或靶向治疗，针对中晚期患者，多行手术治疗联合术后放疗后，但术后患者仍需承受喉功能受损或喉功能丧失的痛苦。相关研究发现人下咽癌FaDu 细胞中STIM1 基因表达显著，实验组凋亡的FaDu 细胞显著提升，STIM1 基因在FaDu 细胞中显著表达，且STIM1 蛋白表达同对照组相比明显受到抑制[13-14]。

细胞凋亡是机体基因调控细胞程序性死亡的主动过程，肿瘤与凋亡关系密切，肿瘤发生多数为凋亡受阻导致，当肿瘤细胞凋亡能力被抑制，未能正常死亡，致使细胞数量增加[15]。通过体外慢性病毒感染实验发现，STIM1 沉默后，FaDu 增殖受到抑制且凋亡情况明显提升，细胞周期被阻滞，细胞克隆能力降低，生长情况减慢。STIM1 基因位于人类染色体11p15.5 区域，其编码蛋白的分子量约为77 KDa，且在真核细胞中钙离子作为细胞内重要的第二信使，细胞质内钙浓度改变及许多生理功能变化密切，蛋白质、内质网膜对钙含量敏感，在细胞静止时可检测少量STIM1，同时实验发现下咽癌肿瘤细胞明显受到STIM1 抑制，能影响肿瘤细胞增殖凋亡及周期，进而抑制肿瘤细胞生长。STIM1 组下咽癌FaDu 细胞数量提升，同时STIM1 表达可抑制癌细胞增殖，确保细胞周期停滞。结果显示：STIM1 基因组细胞蛋白水平表达（0.75±0.23）低于对照组（0.96±0.21）；
STIM1 组细胞凋亡、增殖情况高于对照组，周期情况低于对照组；
STIM1 组细胞数高于对照组，增殖倍数低于对照组（P＜0.05）。宋殿芳等[16]的研究结果显示，STIM1 组与空白对照组相比，STIM1-siRNA 组细胞侵袭能力以及PCNA、MMP-2、β-catenin、c-myc 的蛋白表达（0.63±0.15）均显著降低，同本文结果相似，但本研究主要针对下咽癌进行研究。

综上所述，STIM1 基因对下咽癌疾病FaDu 诱发发展有一定影响，且进一步了解STIM1 与下咽癌临床症状的联系，可发现STIM1 对下咽癌治疗具有一定价值，下咽癌患病位置较为特殊，术后会影响患者交流、呼吸及生存质量，因此STIM1 相关基因对下咽癌FaDu 细胞基因具有影响作用，可作为下咽癌治疗的新切入点。

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