米糠油体的酶法提取工艺优化

吕雯雯，高倩茹，郝 佳，闫秋丽，许朵霞

(1.北京工商大学 食品与健康学院，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京市食品风味化学重点实验室，食品质量与安全北京实验室,北京 100048；

2.北京市经济管理学校,北京 100048)

随着人们对绿色、安全食品的追求，使用天然食品原料已成为未来食品产业的发展趋势。米糠是稻米加工过程中的主要副产品，含有稻米中2/3的营养成分和9/10的人体必需元素，有“天然营养宝库”的称号[1]。米糠中含有15%的蛋白质、16%～22%的脂肪、10%的水分，还含有生育酚、谷维素、角鲨烯等活性物质，具有增强免疫力、治疗肥胖症、预防心血管疾病甚至抗癌的作用[2-4]。我国米糠产量丰富，但存在深加工不足的问题，造成了米糠资源的浪费。

植物油体是天然的微纳米级原料，富含多不饱和脂肪酸、磷脂、生育酚和植物甾醇等生物活性物质，作为天然复合物乳状液，可广泛应用于饮料、乳制品、巧克力和冰淇淋等食品中[5-7]。此外，植物油体为天然乳化剂，作为载体具有良好的输送和释放能力，有利于食品的低能耗生产[8-10]。从米糠中提取米糠油体作为天然乳化剂应用于食品工业中，具有广泛的应用前景，可解决米糠深加工不足的问题。

目前，植物油体的提取方法主要有水法和酶法[11-12]。水法提取效率通常较低；
而酶法提取可以解决此问题，如Kapchie等[13]利用酶法提取大豆油体，选用复合果胶酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶，在60℃、150 r/min条件下处理大豆粉20 h，大豆油体的提取率显著高于水法提取的。目前国内外对于米糠油体的研究不多，且主要是对传统水法提取的米糠油体成分和物理性质的研究。

米糠中含有较多的半纤维素，其中木聚糖含量最高。木聚糖酶可以分解米糠细胞壁及米糠中的木聚糖[14-15]。植物提取酶中包括纤维素酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶和果胶酶，可以显著破坏植物细胞壁[16]。因此，本文拟采用木聚糖酶及植物提取酶针对性地提取米糠油体，以油体得率、粒径分布、稳定性及微观结构为指标，探究复合酶配比、复合酶添加量、pH及酶解时间对米糠油体提取的影响，优化酶法提取米糠油体的工艺条件，为米糠油体的开发与应用提供一定的理论基础。

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

米糠，哈尔滨北大荒米业有限公司。植物提取酶(主要包含纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶，纯度≥99%)，宁夏和氏璧生物有限公司；
木聚糖酶(纯度≥99%)、尼罗蓝(纯度≥98%)、尼罗红(纯度≥98%)，上海源叶生物科技有限公司；
叠氮化钠，分析纯，美国Sigma公司；
氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，河南省予华仪器有限公司；
Allegra X-15R超高速离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；
S3500粒度仪，美国Microtrac公司；
Lumisizer稳定性分析仪，德国L.U.M.GmbH公司；
Eutech 700 pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；
FV3000激光共聚焦显微镜，美国Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米糠油体的制备

将过450 μm(40目)筛的米糠以料液比1∶6(质量比)加入到1 mmol/L的磷酸盐缓冲液中，调节pH，加入复合酶搅拌混匀，50℃下酶解一定时间后，4 500 r/min、23℃离心20 min，取上层，即为米糠油体，在米糠油体中加入0.01%的叠氮化钠防止微生物生长。按下式计算米糠油体得率(x)。

x=m1/m2×100%

(1)

式中：m1为米糠油体质量，g；
m2为米糠质量，g。

1.2.2 米糠油体粒径分布的测定

采用S3500粒度仪测定米糠油体的粒径分布。取一定量样品，用1 mmol/L磷酸缓冲液稀释400倍，以水为介质，连续相和分散相的折射率分别设为1.33和1.45，湿法测量。

1.2.3 米糠油体稳定性分析

使用Lumisizer稳定性分析仪测定米糠油体的稳定性。取0.4 mL样品，在转速4 000 r/min、测试温度25℃、扫描间隔60 s/次、扫描次数255次条件下，测定样品的移动速率。

1.2.4 米糠油体微观结构分析

采用FV3000激光共聚焦显微镜分析米糠油体微观结构。在米糠油体中加入油体质量的0.02%尼罗红对油相进行染色，取少量染色样品置于载玻片上，用60倍目镜进行观察，调节激发波长为488 nm和635 nm。

1.2.5 米糠油体中脂肪和蛋白质含量的测定

采用索氏抽提法测定米糠油体脂肪含量；
采用BCA法测定米糠油体蛋白质含量。

1.2.6 数据分析

数据采用Excel 2017及SPSS 17.0软件进行统计分析，用OriginPro 8.5.1进行绘图，实验重复3次，结果以“平均值±标准差”表示。

2.1 复合酶配比对米糠油体得率和性质的影响

在复合酶添加量为2%、pH为5.0、酶解温度为50℃、酶解时间为1.5 h条件下，调整复合酶配比(木聚糖酶与植物提取酶质量比，下同)分别为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，从米糠油体得率、粒径分布、稳定性与微观结构方面研究复合酶配比对米糠油体制备的影响。

2.1.1 得率

复合酶配比对米糠油体得率的影响见图1。从图1可以看出，随着木聚糖酶所占比例的增大，米糠油体得率呈现先增大后减小的趋势，复合酶配比为2∶1时，米糠油体得率最大，为73.6%。可能是因为米糠中含有较多的木聚糖，当木聚糖酶占比增加时，米糠中的木聚糖被充分酶解，米糠油体释放增加；
但当木聚糖酶占比再增加，则植物提取酶占比过少，无法充分破坏细胞壁，导致米糠油体释放减少，得率降低。

图1 复合酶配比对米糠油体得率的影响

2.1.2 粒径分布及稳定性

复合酶配比对米糠油体粒径分布的影响见图2。

图2 复合酶配比对米糠油体粒径分布的影响

由图2可看出，当复合酶配比为1∶3和1∶2时，米糠油体粒径呈双峰分布，且粒径较大，可能是由于油体液滴聚结所致。随着木聚糖酶所占比例的增大，油体粒径呈单峰分布，表现出均一性。复合酶配比为2∶1时，液滴粒径最小，为8.37 μm，在该条件下提取的米糠油体液滴均匀性最佳。

复合酶配比对米糠油体稳定性的影响见图3。移动速率值越小，样品体系越稳定[17]。由图3可看出，随木聚糖酶所占比例的增大，米糠油体稳定性逐渐增大，复合酶配比为2∶1时，米糠油体稳定性最高。此后，木聚糖酶占比再增大，米糠油体稳定性不再发生改变。因此，复合酶配比为2∶1时，米糠油体粒径分布最均一，粒径最小且稳定性最好。

图3 复合酶配比对米糠油体稳定性的影响

2.1.3 微观结构

复合酶配比对米糠油体微观结构的影响见图4。由图4可看出，复合酶配比为1∶3和1∶2时，米糠油体凝结明显，大小分布不均匀，多形成大油滴。复合酶配比为1∶1和2∶1时，米糠油体聚集体粒径变小，油体呈现出相对稳定的状态。复合酶配比为3∶1时，米糠油体粒径变大，由之前的聚结状态变为絮凝状态，导致油体失稳。

图4 复合酶配比对米糠油体微观结构的影响

综上，米糠油体提取的最佳复合酶配比为2∶1。

2.2 复合酶添加量对米糠油体得率和性质的影响

在复合酶配比为2∶1、pH为5.0、酶解温度为50℃、酶解时间为1.5 h条件下，调整复合酶添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%(以体系质量计)，从米糠油体得率、粒径分布、稳定性与微观结构方面研究复合酶添加量对米糠油体制备的影响。

2.2.1 得率

复合酶添加量对米糠油体得率的影响见图5。从图5可以看出，随着复合酶添加量从1%增加到5%，米糠油体得率呈现先增加后降低的趋势，复合酶添加量为3%时，米糠油体得率最大，为79.5%。酶添加量增大，使得酶与底物的接触面积增大，从而使米糠细胞壁被充分破坏，释放出更多的油体[18]；
但酶的过度添加会导致油体完整性被破坏，降低米糠油体得率。

图5 复合酶添加量对米糠油体得率的影响

2.2.2 粒径分布及稳定性

复合酶添加量对米糠油体粒径分布的影响见图6。

图6 复合酶添加量对米糠油体粒径分布的影响

从图6可以看出，复合酶添加量为1%～3%时，米糠油体粒径较小且均一，呈单峰分布，这可能是由于复合酶将细胞壁上部分多糖水解为单糖，适量的单糖可能在油体的油水界面上与蛋白质相互作用产生强烈的空间作用力，有效阻碍了油体间的聚结[19]。同时，随着复合酶添加量的增加，米糠油体的粒径分布峰值向更小的尺寸移动，复合酶添加量为3%时，粒径最小。但是，复合酶添加量超过3%时，米糠油体粒径呈现双峰分布，粒径大小不均一。

复合酶添加量对米糠油体稳定性的影响见图7。从图7可以看出，随着复合酶添加量的增加，米糠油体稳定性呈现先增加后降低的趋势。复合酶添加量为3%时，米糠油体稳定性最好，可能是由于该条件下米糠油体具有较小的粒径及较好的分散性。因此，复合酶添加量为3%时，米糠油体粒径分布最均一，粒径最小且稳定性最好。

图7 复合酶添加量对米糠油体稳定性的影响

2.2.3 微观结构

复合酶添加量对米糠油体微观结构的影响见图8。从图8可以看出，复合酶添加量为1%时，米糠油体表现出明显的聚结，多形成大油滴，在宏观上表现为不稳定的状态，这可能是细胞壁没有被充分水解，体系中单糖含量少，不足以与界面膜上的蛋白质形成共聚物，导致油体液滴之间空间作用力弱，从而使液滴间发生聚结。当复合酶添加量增加至2%～3%时，油体分布均匀，粒径大小集中，宏观体系表现为稳定状态，主要是因为体系中单糖含量增加，可以与界面膜上的蛋白质充分作用，形成共聚物，使油体表面界面膜变厚，从而提高米糠油体稳定性[20]。当复合酶添加量再增大时，米糠油体液滴出现絮凝现象，且形成较多不规则的大油滴，这可能是由于体系中单糖含量过多，出现损耗絮凝，导致米糠油体失稳。

图8 复合酶添加量对米糠油体微观结构的影响

综上，米糠油体提取的最佳复合酶添加量为3%。

2.3 pH对米糠油体得率和性质的影响

在复合酶配比为2∶1、复合酶添加量为2%、酶解温度为50℃、酶解时间为1.5 h条件下，调节pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，从米糠油体得率、粒径分布、稳定性与微观结构方面研究pH对米糠油体制备的影响。

2.3.1 得率

pH对米糠油体得率的影响见图9。pH对于酶活性有显著性影响，未处于最适pH时，酶活性较低。由于本研究中两种细胞壁多糖酶的最适pH不同，因此将其复配后，需要重新验证最适pH。从图9可以看出，随着pH的增大，米糠油体得率呈现先增大后降低的趋势，pH为5.5时，米糠油体得率最高，为75.6%。

图9 pH对米糠油体得率的影响

2.3.2 粒径分布及稳定性

pH对米糠油体粒径分布的影响见图10。

图10 pH对米糠油体粒径分布的影响

从图10可以看出，在pH 4.0和pH 4.5条件下，米糠油体的粒径呈双峰分布，粒径分布不均，发生油体聚结，可能是由于米糠油体表面蛋白质等电点在pH 4.0左右，使得蛋白质沉淀，米糠油体失稳。pH在5.0～6.0时，米糠油体粒径呈单峰分布，粒径分布均匀，主要集中在8 μm左右。

pH对米糠油体稳定性的影响见图11。从图11可以看出，pH 在4.0～6.0范围内，米糠油体的稳定性呈现先增高后降低的趋势，pH为5.0时，米糠油体的稳定性最佳。因此，pH为5.0时，米糠油体粒径分布最均一，粒径最小且稳定性最好。

图11 pH对米糠油体稳定性的影响

2.3.3 微观结构

pH对米糠油体微观结构的影响见图12。从图12可以看出，pH为4.0时，米糠油体聚结形成较多的大油滴，稳定性差，与粒径分布的结果一致。pH增大到5.0时，米糠油体大小分布集中，分散均匀，呈现出稳定的状态。pH在5.5～6.0范围内，米糠油体发生絮凝，逐渐失稳，主要是因为米糠油体空间相互作用力减弱。

图12 pH对米糠油体微观结构的影响

综上，米糠油体提取的最佳pH为5.0。

2.4 酶解时间对米糠油体得率和性质的影响

在复合酶配比为2∶1、复合酶添加量为2%、pH为5.0、酶解温度为50℃条件下，分别搅拌反应0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，从米糠油体得率、粒径分布、稳定性与微观结构方面研究酶解时间对米糠油体制备的影响。

2.4.1 得率

酶解时间对米糠油体得率的影响见图13。从图13可以看出，随着酶解时间的延长，米糠油体得率呈现先增加后降低的趋势，酶解时间为1.5 h时，米糠油体得率最高。

图13 酶解时间对米糠油体得率的影响

2.4.2 粒径分布及稳定性

酶解时间对米糠油体粒径分布的影响见图14。从图14可以看出，酶解时间在0.5～2.0 h时，米糠油体粒径呈单峰分布，酶解时间为1.5 h时，米糠油体粒径分布最集中，酶解时间延长至2.5 h时，米糠油体粒径呈双峰分布，出现大的聚集体，可能是由于酶解时间的延长，油体的界面膜被破坏，油滴聚合导致。

图14 酶解时间对米糠油体粒径分布的影响

酶解时间对米糠油体稳定性的影响见图15。从图15可以看出，随着酶解时间的延长，米糠油体稳定性呈现先增大后降低的趋势。酶解0.5～1.0 h时，米糠油体稳定性差，可能是由于酶解时间过短，酶解不充分，仅少量油体被释放出来，游离的少量油体空间作用力弱。酶解1.5 h时，米糠油体显示出较好的稳定性，可能是由于该条件下米糠酶解充分，大量油体被释放出来，油体间的空间作用力较强[21]。但随着酶解时间的继续延长，体系中的油滴发生聚结，体系失稳，从而导致稳定性变差。因此，酶解时间为1.5 h时，米糠油体粒径分布最均一，粒径最小且稳定性最好。

图15 酶解时间对米糠油体稳定性的影响

2.4.3 微观结构

酶解时间对米糠油体微观结构的影响见图16。从图16可以看出，酶解时间为0.5 h时，米糠油体粒径分布不均，有强烈的絮凝及聚结作用，表现为不稳定状态。当酶解时间延长至1.5 h时，米糠油体粒径逐渐变小，分布均匀，无明显的絮凝和聚结，稳定性良好。继续延长酶解时间，米糠油体又表现出不稳定状态，可能是酶解过度导致油体完整性被破坏。这与粒径及稳定性的结果一致。

图16 酶解时间对米糠油体微观结构的影响

综上，米糠油体提取的最佳酶解时间为1.5 h。

2.5 米糠油体基本组成

在酶法提取米糠油体的最佳工艺条件(复合酶配比为2∶1，复合酶添加量为3%，pH为5.0，酶解时间为1.5 h，酶解温度为50℃)下提取米糠油体，检测米糠油体的基本组成，可得干基条件下米糠油体中脂肪含量为(87.37±0.16)%，蛋白质含量为(12.63±0.14)%。

选用木聚糖酶和植物提取酶，以油体得率、粒径分布、稳定性及微观结构为考察指标，对酶法提取米糠油体的条件(复合酶配比、复合酶添加量、pH、酶解时间)进行了优化。结果显示，在木聚糖酶与植物提取酶质量比2∶1、复合酶添加量3%、pH 5.0、酶解温度50℃和酶解时间1.5 h条件下提取米糠油体，所得米糠油体得率高，粒径分布集中，粒径达到微米级，且酶法提取不会破坏米糠油体表面蛋白质，得到的米糠油体稳定性良好、结构完整。本研究为米糠油体的开发与应用提供一定的理论基础，对于提高油体稳定性和拓宽油体在食品领域的应用有重要意义。

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