“脾肾相关”理论探讨脂肪源性外泌体在老年性骨质疏松症中的研究进展

秦威城 尚奇 张鹏 张学来 张志达 余翔 梁德 任辉 江晓兵* 沈耿杨*

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405 2.广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州 510405 3.广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科，广东 广州 510405

老年性骨质疏松症(senile osteoporosis，SOP)及其导致的严重并发症，在全球医疗、公共卫生和经济等领域产生重大的负面影响，因此如何有效地防治SOP是当今人口老龄化社会迫切需要解决的一个重要临床科研课题。应用中医药治疗SOP是一项我国独具特色的治疗方法，且目前基础研究和临床应用皆证实其治疗SOP具有显著的治疗效果[1-2]。但是中医药防治SOP的具体机制不明确，这在一定程度上对于其在临床上的运用会造成限制。

骨骼和脂肪在功能上相互联系，这与中医学“脾肾相关”理论相符[3]。最新研究表明，外泌体作为一种细胞外囊泡可携带多种生物活性分子，在“骨-脂肪 Crosstalk”(即骨与脂肪间存在交互作用的关系)中发挥关键调控作用。因此，本文基于脾肾相关理论对脂肪源性外泌体在SOP中的作用进行探讨，以期为临床防治SOP提供新思路。

肾与骨的关系最早出现在《黄帝内经》，其谓：“肾之合，骨也”，这其中是以“肢节内合脏腑”作为理论依据进行阐述。同时，肾作为五脏六腑中的先天之本，具有储存和封藏精气的作用，主骨骼的生长和化生骨髓，说明肾与骨之间有着密不可分的关系[4]。机体面对年龄的增长，其生理状态会呈现出对应的改变，《素问·上古天真论》对此进行明确的表述，实则揭示了人生长发育的自然规律。即骨骼依靠肾精的濡养得以生长发育，肾精的盈缺是骨健壮与否的关键。令骨骼获得肾精的濡养则健壮，反之则髓减骨枯。因此，临床中因为骨的病理变化导致的多种骨病，如骨痹、骨痿等，应首当责之于肾，辨证论治皆不离于肾。故此骨骼的固护，须依靠肾精的滋养[5]。

中医学对脂肪相关内容进行记载的古籍可以追溯至《黄帝内经》，其中的津液学说和膏脂学说以“有膏、有脂、有肉”来描述人体的组成[6]。《礼记·内则》中对于膏脂的论述以“凝者为脂，释者为膏”进行区分；
明代张景岳在《类经》里也存在类似的评说，即膏脂二者起源相同，形态不同。清代张志聪对于《内经》的注解中提及，津液经由脾胃的运化，“溢于外则皮肉膏肥，余于内则膏盲丰满”。结合中医理论可知，膏脂，乃水谷精微经由脾胃中焦所化生而成，归属津精。

肾藏精，为脏腑阴阳之本，先、后天之精皆为肾所储存及封藏。前者禀受于父母的生殖之精，后者是经由脾胃生化产生的水谷之精气。即膏脂同样为“后天之精”所化生，身为后天之精的脂肪对于骨的生长衰退同样具有固护作用。目前鲜有人视脂肪为后天之精进行深入分析，本文将首次基于中医角度探讨脂肪与骨质疏松症间的关系，以为将来提供新的研究思路及意义。

在生命过程中，骨骼的形成需要经过建模和重建的过程。骨骼建模是骨骼根据生理状况或所承受的机械力而改变形状或大小的过程，与此同时伴行着骨骼重建，以维持骨骼的强度和矿物质的动态平衡[7]。骨稳态是由骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨细胞、破骨细胞和脂肪细胞等细胞以及其所处的微环境构成。微环境中，成骨细胞[8]和破骨细胞[9]相互调控，协同控制骨量，这对于持续性维持骨量的稳定起着关键作用。骨形成和吸收的失衡所引起的骨稳态失调，进而会诱发一系列骨代谢相关疾病，如骨质硬化、骨质软化和骨质疏松症(osteoporosis，OP)等[10]。同样来源于BMSCs的骨髓脂肪细胞可能影响骨形成和骨吸收维持的骨稳态平衡。脂肪细胞是人类骨髓中含量最丰富的细胞类型之一(15%～70%)[11]，骨髓脂肪细胞的数量和大小随着年龄增长和骨丢失疾病的发生(如OP)而发生明显的变化[12]。因此，越来越多的研究开始重视骨髓脂肪细胞在骨重建生理过程中的关键作用以及这些细胞与骨丢失疾病的相关性。

BMSCs作为一种共同的祖细胞，其严格控制的增殖分化机制在维持骨稳态中起着尤为关键的作用。由于BMSCs可分化为多种细胞类型[13]，所以其成骨和成脂分化失衡与病理性骨重建密切相关[14-16]。相关研究表明，在包括年龄在内的各种病理条件下，大多数骨丢失的过程皆存在骨髓脂肪增加[17-18]。

人体衰老过程中，由于BMSCs的成骨和成脂之间分化的平衡逐渐偏移，导致原本发生的骨丢失和某些病理过程将会伴随着骨髓脂肪的增加[19]。然而，这种平衡改变的具体机制尚不清楚。基于当前的研究表明，对比年轻BMSCs，衰老型BMSCs的成骨分化程度明显降低，证明衰老限制BMSCs在骨再生方面的潜力[20]。同时，BMSCs的衰老是一个动态的过程，伴随着代谢、转录组的遗传和表观遗传调控以及多条信号通路的功能变化[21-22]。Hu等[23]通过筛选年轻和衰老的人BMSCs的基因表达谱，发现核小体组装蛋白1-样蛋白2(NAP1L2)的表达上调与BMSCs衰老和成骨分化降低同时相关。随着年龄的增长，活性氧和氧化应激增加将进一步通过Wnt和PPARγ途径在老年性骨丢失和脂肪成骨分化中发挥重要作用[24-25]。PPARγ作为成脂分化的中心转录因子，能够抑制成骨细胞分化。Suo等[26]证明了通过敲除RNA结合蛋白Musashi2(MSI2)以增加衰老型BMSCs中PPARγ的表达，能够促进脂肪生成，抑制成骨。越来越多的证据表明，当促进BMSCs向成骨方向分化时，同时存在着BMSCs向成脂分化的减少。诸多因素严格调控着BMSCs的增殖分化，因此彼此间构成了一个复杂的网络，以精确调节BMSCs。临床和动物研究也同样支持这一观点，即骨髓脂肪的含量与骨量呈负相关[17,27-28]。促进脂肪生成的信号(如噻唑烷二酮[29]、地塞米松[30]和成纤维细胞生长因子-21[31])抑制成骨，而抑制脂肪生成的信号(如Wnt10b信号[32-33])促进成骨细胞分化。虽然BMSCs的互相调节可以解释随着年龄增加，脂肪的扩张和骨量的减少[17]，但所涉及的特定的作用和信号通路尚未被明确诠释。

基于Wnt/β-catenin和PPARγ信号通路，BMSCs在向成脂或成骨分化的过程中二者互相拮抗。虽然骨量减少与骨髓腔内脂肪增多总是相伴出现，但是由于脂肪来源的间充质干细胞(ASCs)易于大量获取和分离，并且它们具有很高的增殖分化能力，使得脂肪组织成为一种骨组织工程修复材料[34]。而且ASCs通过旁分泌作用释放生物活性因子，可以促进骨组织血管生成和成骨细胞分化[35-36]。

外泌体作为胞外囊泡的一类，具有传递细胞信息、介导机制调控的功能。其中包含着丰富的蛋白质、DNA、RNA等基因遗传物质，外泌体内含物的种类和数目由遗传基因和所处的内环境双方面决定，不同细胞分泌的外泌体之间的功能也随之不同[37]。外泌体基于Wnt/β-catenin、RANKL等机制调控着骨稳态，对于BMSCs、成骨细胞、破骨细胞的增殖分化起着至关重要的作用。Wei等[38]发现过表达miR-424-5p的外泌体能够通过WIF1/Wnt/β-catenin通路抑制BMSCs的成骨分化，提示miR-424-5P可能是治疗OP的一个生物标志物。目前，运用外泌体治疗OP逐渐引起人们的关注，并且已有学者对其进行探讨和综述[39-41]。进一步研究表明，脂肪间充质干细胞来源的外泌体(ASCs-exo)能促进人成骨细胞的增殖和成骨分化[42]。当用TNF-α预处理ASCs时，ASCs-exo中Wnt-3a的含量增加，并且抑制Wnt信号降低了在TNF-α预处理的ASCs条件培养液中成骨基因的表达水平。说明ASCs-exo特别是以TNF-α预处理的ASCs-exo为替代干细胞直接移植进行骨修复和再生提供了一条具有较大前景的途径。而且ASCs-exo可拮抗缺氧加血清剥夺(H/SD)方法诱导的骨细胞凋亡和破骨细胞生成，提示了ASCs-exo具有治疗SOP的潜力[43]。因此，ASCs-exo具有促进增殖和抑制凋亡等多种功能，在无细胞治疗方面具有广阔的应用前景。

ASCs-exo通过上调早期炎症和增强血管生成，起着促进脂肪生成的作用，并增加胶原合成水平，在组织修复和再生中可能发挥关键作用[44]。Lv等[45]利用胞外miRNA转运颗粒的天然可用性和生物相容性，通过电穿孔将miR-21-5p负载到ASCs-exo中。进而ASCs-exo在体外通过Wnt/β-catenin通路促进角质形成细胞的增殖和迁移，在体内通过促进再上皮化、胶原重塑、血管生成和血管成熟而促进糖尿病创面愈合。这项研究的结果将为应用ASCs-exo传递药物物质和开发用于伤口愈合治疗的无细胞疗法奠定基础。另一研究表明，ASCs-exo在转基因小鼠源性阿尔茨海默病体外模型中具有调节作用，可以作为一种治疗方式以防止淀粉样β蛋白肽诱导的神经元死亡和阿尔茨海默病的进一步恶化[46]。同时，Rosanna等[47]发现ASCs来源的外泌体mRNAs和miRNAs可显著促进体外培养的神经突起生长，这可能是以后干预神经修复中的一个有用辅助手段。然而脂肪源性外泌体调控骨稳态的具体机制尚未被阐明，值得进一步探讨。

SOP属中医学“腰痛、痹病、骨痿”范畴，其病位在骨骼，同时与肾脾相关，病因病机多为肾虚、脾虚、血瘀。肾主骨生髓，为先天之本，脾主肌肉、充四肢，为后天之源，二者相互资生，稳定正常生理功能。随着年龄的增长，人体五脏六腑功能开始逐渐衰退，外形可见骨枯肉削，其中脾肾虚损为SOP病机所在。在人体自然衰老过程，《素问·上古天真论篇》云：“五七，阳明脉衰……五八，肾气衰”，可见五脏皆衰的产生首见于脾肾。说明SOP主要病机为脾肾不足，骨削肉减，髓空骨枯，骨肉不亲。

脾主运化水谷精微，生化气血以濡养机体，因此全身脏腑组织的濡养和能量来源，都依赖于脾胃中焦的水谷运化。随着年龄的增长，人的脾胃功能开始衰退。脾主肌肉，若脾胃虚衰，则肌肉筋骨失去濡养。《脾胃论·脾胃胜衰论》指出：“脾病则下流乘肾……是为骨蚀”，说明脾气亏虚，亦当损及肾。肾虚精亏，骨髓空亏，进一步加重SOP的发生发展。《医经精义》中提及骨为肾之合，髓为肾精所生。肾-髓-骨关系密切，肾精充盈则髓充盈，髓充盈则骨强健。肾主骨生髓，为先天之本，与骨的生长发育密切不可分。若骨得髓养，则强健有力；
若气血无源，肌肉失养，亦见骨痿。人体老龄化导致的脾虚肾亏，使得先后天之精不足以濡养固护骨骼。

当前对于SOP脾肾亏虚证患者中外泌体的相关研究鲜有文献报道。不过在其他疾病中，已有学者将脾肾亏虚证与外泌体间的关系进行探讨及研究。比如，伍琴[48]在早发性卵巢功能不全肾虚血瘀证的患者中发现外泌体数量较正常组少，这证实外泌体可能与肾虚血瘀证的卵巢功能损伤相关。同时，在脾虚证的整体内环境下，外泌体中的细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)可通过调节PTEN/CD44信号通路，促进肝癌的增殖、自我更新和转移[49]。因此，脾肾亏虚所导致的SOP与外泌体，二者同样可能存在一定的关联，值得进一步阐述。

骨髓脂肪与骨量的关系和ASCs-exo的促进骨形成作用，这两个看似矛盾的联系，恰好符合中医脾肾相关理论。从骨的角度来看，先后天之精所带来的功能与分子生物学的BMSCs和ASCs的功能相似。有学者认为，骨髓为中医所指的先天之精，而脂肪为后天之精，在二者中起关键作用的当属BMSCs和ASCs，且都具备发展成骨细胞的性质。随着老年的到来，肾中精血渐亏，精亏髓减，先天不足，则后天失养。进一步导致脾虚难以运化，后天之精逐渐匮乏，使得先后天之精不足以濡养固护骨骼。随之带来的是ASCs的减少，ASCs-exo对于骨稳态中促进骨形成的成骨作用间接性降低，而机体骨骼内的成脂作用将相对增加。脾肾亏虚导致的一系列变化，会引起SOP的发病率增加。因此，基于ASCs-exo调控骨稳态的机制，将为脾肾相关理论的补肾健脾方防治SOP提供一个新的治疗思路以及分子靶点。

综上所述，面对人口老龄化所带来的SOP患病率逐年增加的情况[50]，寻找安全、高效的疗法值得进一步探索。虽然中医和现代医学的“骨-脂”关系存在差异，但却有一定联系性，中西医理论的融合有助于深入了解SOP的发病机制。通过对SOP的发病机制结合中医脾肾相关理念进行探讨，为中医药补肾健脾方治疗SOP的治疗靶点提出新的理论。目前ASCs-exo调控骨稳态的机制还处于研究阶段，仍然需要对其具体的机制进行验证。

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