基于网络药理学的山豆根调控白细胞跨内皮迁移通路改善急性咽炎的作用机制

党兆岩，刘 畅，何倩倩，俸婷婷，权 伟，董 秀，周 英,3

(1.贵州中医药大学药学院/药食两用资源应用与开发研究中心，贵州 贵阳 550025；
2.贵州三力制药股份有限公司，贵州 安顺 561100；
3.贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025)

山豆根(SophoratonkinensisGagnep)是槐属豆科植物山豆根的干燥根与根茎的统称，目前广泛用于治疗咽咙肿痛、牙龈肿胀和病毒性肝炎等[1]。其主要成分为三萜类化合物、黄酮和喹啉利啶生物碱。药理研究表明，山豆根具有多种药理活性，包括抗炎、抗肿瘤、抑制胃酸分泌，等等[2]。山豆根常用于治疗炎症性疾病，包括咽炎、扁桃体炎等。最近的研究表明，从山豆根中分离得到的黄酮类化合物苦参素B和6，8-二戊烯基-7，4′-二羟基黄烷酮具有抗炎作用[3]。越来越多的证据支持山豆根治疗炎症性疾病，以及作为一种天然药物来衍生治疗炎症药物制剂[4]。

急性咽炎是咽部黏膜和周围淋巴组织的炎症，往往是由各种病毒或细菌感染所引起的。急性咽炎是一种非常常见的疾病，通常是良性的[5]。急性咽炎相关的咽痛、发烧和咽部异物感会令人感到不适[6]。导致喉咙痛的非传染性因素非常多，包括物理化学因素(如吸烟、打鼾、喊叫、吸毒)和环境因素(如污染、温度、湿度)[7]。急性咽炎的模型通常是使用氨水、辣椒素等刺激物建立的，这些刺激物被用来模拟环境污染或不健康的人类生活方式。目前急性咽炎的临床治疗主要围绕糖皮质激素、抗生素和非甾体类抗炎药(NSAIDs)的使用。然而，长期使用阿司匹林或地塞米松等药物治疗可能会导致胃黏膜、肝脏或肾脏损伤，以及其他不可预见的副作用。研究表明，许多中药对急性咽炎有有益的作用，有可能减缓过度的炎症进展，恢复咽喉组织部位的稳态[8-9]。

本研究首先通过中药网络药理学方法，预测山豆根改善急性咽炎的潜在成分、作用靶点和分子通路，接着利用动物实验和荧光定量PCR技术实验进行进一步的验证，阐明山豆根改善急性咽炎的潜在机制，以期为山豆根改善急性咽炎的作用机制提供方法和理论依据。

1.1 实验动物、药材与试剂SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量(180±20) g，购于西南医科大学实验动物中心，实验动物合格证号SYXK(川)2018-17。动物实验方案符合贵州中医药大学实验动物伦理委员会审查批准要求，且实验均按照相关指导原则和规定进行。

山豆根，贵州三力制药股份有限公司提供，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为豆科越南槐(SophoratonkinensisGagnep)的干燥根及根茎。称取山豆根1 000 g，置2 000 mL圆底烧瓶中，以10倍量、8倍量、8倍量水回流提取3次，每次1 h，合并3次滤液，浓缩得浸膏，低温保存备用。白细胞介素6(IL-6，ZC36404-2106A28)、白细胞介素10(IL-10，ZC36379-2106A19)、前列腺素E2(PEG2，ZC37100-2106A21)检测试剂盒，上海茁彩生物科技有限公司，总RNA提取试剂盒(W9908)、逆转录试剂盒(W9813)，荧光定量试剂盒(W9611)，天根生化科技(北京)有限公司，水合氯醛(0616A20)，北京市雷根生物技术有限公司。

1.2 仪器、数据库及分析软件Multlskan Mk3酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司)，数码三目摄像显微镜(麦克奥迪实业集团)，N60系列超微量分光光度计(德国IMPLEN)，CFX Connect三通道梯度荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

中药系统药理学数据库和分析平台(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)；
UniProt数据库(https：// www.uniprot.org /)；
GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)；
OMIM数据库(http：//www.omim.org/)；
Venny2.1.0数据库(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；
Metascape数据库(https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)；
STRING数据库(https：//string-db.org/)；
Swiss Target Prediction数据库(https：//www.sib.swiss/)；
the Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)数据库(http：//www.genome.jp/kegg/)；
bioinformatics数据库(http：//www.bioinformatics.com.cn/)；
Cytoscape3.8.2软件；
GraphPad Prism 6.0软件。

1.3 山豆根改善急性咽炎的网络药理学研究

1.3.1获取山豆根有效活性成分和候选作用靶点 利用TCMSP获取山豆根的活性成分。以“山豆根”为检索词，依据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug likeness，DL)≥0.18筛选收集。将所得活性成分在Swiss Target Prediction中筛选得到山豆根相关靶点，利用UniProt数据库校正靶点基因名，限定物种为“Homosapiens”，获取山豆根有效活性成分对应的作用靶点。

1.3.2构建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶点”网络 利用Genecards数据库(相关性评分≥1.0)和OMIM数据库，以“acute pharyngitis”检索急性咽炎潜在靶点，合并去除重复后，收集急性咽炎相关靶点。利用韦恩图获取山豆根和急性咽炎的共同靶点，并通过Venny软件绘制韦恩图显示。通过Cytoscape软件构建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶点”网络。

1.3.3构建蛋白相互作网络 利用String数据库构建靶标蛋白相互作用(protein-proteininteraction，PPI)。将“1.3.2”获取的交集靶点导入String数据库，限定物种“Homosapiens”，并以置信度≥0.9，获取靶点网络。将其导入Cytoscape软件中优化PPI。利用bioinformatics显示PPI网络中排名前20的核心蛋白靶点。

1.3.4通路和功能富集的分析 为进一步研究山豆根改善急性咽炎机制，利用Metascape对获得的靶标进行GO富集分析和KEGG通路分析。然后把山豆根活性成分、靶点以及排名前20的KEGG通路等数据导入Cytoscape软件中，构建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶点-通路”网络。

1.4 山豆根改善急性咽炎的作用机制

1.4.1建立大鼠急性咽炎模型 60只SPF级SD大鼠，♀♂各半，适应性喂养1周，随机分为6组，每组10只，空白组(KB，蒸馏水)，模型组(MX)，阿莫西林阳性药组(YX，0.20 g·kg-1)，山豆根低剂量组(DJ，2.16 g·kg-1)，山豆根中剂量组(ZJ，8.64 g·kg-1)，山豆根高剂量组(GJ，34.65 g·kg-1)。除空白组外，用喉头喷雾器将10%氨水向各组大鼠咽部喷雾(散布面积150 mm2)，上、下午各1次，每次3下，连续3 d，使咽部黏膜因急性刺激而充血肿胀，形成急性炎症，建立大鼠急性咽炎模型[10]。造模3 d后，各组灌胃给予相应剂量药液，每天1次，连续7 d。各组禁食不禁水12 h，处死前记录体质量，腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉，取血清、咽部组织测定各项指标。

1.4.2咽部病理组织学变化及血清指标检测 咽部组织用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜观察咽部组织病理形态变化。腹腔主动脉取血，血液于4 ℃静置1 h，析出血清，4 ℃，3 500 r·min-1离心15 min，按照试剂盒方法检测血清中IL-6、IL-10、PEG2的含量。

1.4.3荧光定量PCR法检测白细胞跨内皮迁移信号通路关键基因的表达 提取大鼠咽部组织总RNA，使用cDNA第一链合成预混试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测白细胞跨内皮迁移信号通路关键基因的表达，以GAPDH作为内参。采用SYBRGreenMaster(Rox)(Roche)在伯乐荧光定量PCR仪器上完成操作，每组实验生物学重复3次。利用Primer 3在线软件(https；
//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计整合素亚基β1(integrin subunit β1，ITGB1)，蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PRKCα)，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基δ(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-Kinase catalytic subunit delta，PIK3CD)，蛋白质酪氨酸激酶2(protein tyrosine Kinase 2，PTK2)，整合素亚基β2(integrin subunit beta 2，ITGB2)，蛋白激酶Cβ(protein kinase Cβ，PRKCB)，蛋白质酪氨酸磷酸酶非受体11型(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11，PTPN11)，整合素亚基α4(integrin subunit α4，ITGA4)，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase，catalytic subunit α，PIK3CA)，GAPDH引物(Tab 1)。荧光定量PCR数据利用公式2-ΔΔCT进行计算。

Tab 1 Primer sequence

2.1 获取山豆根有效活性成分和候选作用靶点在TCMSP数据库共获得79个山豆根有效成分。根据OB≥30%和DL≥0.18共筛选21种潜在的有效成分，编号为S1-S21(Tab 2)。在Swiss Target Prediction中筛选后，用UniProt数据库校正共得到509个作用靶点。

Tab 2 The 21 active ingredients of Sophora tonkinensis Gagnep and number of corresponding targets

2.2 急性咽炎潜在靶点的收集通过GeneCards数据库(相关性评分≥1.0)和OMIM获取急性咽炎相关的靶点，合并剔除重复值后共获得2 167个急性咽炎潜在靶点。

2.3 构建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶点”网络将收集的509个山豆根潜在靶点与急性咽炎的2 167个潜在靶点相匹配，运用韦恩图得到山豆根急性咽炎共同靶点数目194个，同时利用Venny2.1软件绘制韦恩图(Fig 1)。

将共同靶点导入Cytoscape3.8.2软件，构建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶点”网络(Fig 2)。此网络有206个节点，包括山豆根(橙色的三角形)、急性咽炎(黄色的圆形)、山豆根21个活性成分(蓝色的V形)、194个山豆根和急性咽炎的共同靶点节点(绿色的菱形)和1 071条边。其中异鼠李素(S2)、醉茄素(S6)、大豆皂苷E(S9)、山奈酚(S20)、槲皮素(S21)是山豆根改善急性咽炎的关键活性成分，与100个靶点直接相关(Tab 2)。

Fig 1 Venn diagram of common target of Sophora tonkinensis Gagnep and acute pharyngitis

2.4 PPI网络的构建与分析将194个共同靶标导入String数据库，限定物种“Homosapiens”，并以置信度≥0.9进行过滤。将其导入Cytoscape3.8.2软件构建优化PPI网络有145个节点(隐藏离散节点)代表所有预测靶标(Fig 3)，边线508条，代表靶标之间的相互联系。其中综合数值评分>0.95的相互作用蛋白有AKT1-HSP90AA1、AKT1-MTOR、CCNB1-CDK2、CCNB1-CDK1、CCND1-CDK2等280个，这些蛋白间的相互作用在PPI中占有重要地位。对PPI网络进行分析，根据连接度、介度与紧密度确定网络中关键核心靶点，利用bioinformatics可视化PPI网络中排名前20的关键核心靶点，绘制核心靶点水平条形图(Fig 4)。

2.5 通路和功能富集的分析为深入研究山豆根改善急性咽炎的作用机制，本研究利用Metascape平台对山豆根和急性咽炎194个共同靶标进行GO富集和KEGG通路分析。共得到2 394个GO富集条目，包括2 058个生物学过程条目，208个分子功能和128个细胞成分条目。在生物学过程方面，山豆根改善急性咽炎主要涉及cellular response to nitrogen compound信号通路(GO：1901699)、：response to drug(GO：0042493)、positive regulation of protein phosphorylation(GO：0001934)等。在细胞成分中主要涉及postsynapse(GO：0098794)、membraneraft(GO：0045121)等。分子功能富集主要涉及protein kinase activity(GO：0004672)、neurotransmitter receptor activity(GO：0030594)、transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity(GO：0004714)等。根据P<0.05，筛选出排名前10个GO富集条目，并利用bioinformatics进行可视化(Fig 5)。

通过KEGG通路分析，共富集到344条信号通路。山豆根改善急性咽炎主要涉及白细胞跨内皮迁移信号通路、幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号通路、癌症中的转录失调等。根据P<0.05，筛选出排名前20的通路，并利用bioinformatics进行可视化(Fig 6)。

2.6 构建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶点-通路”网络最后将山豆根的有效成分、山豆根和急性咽炎的共同靶标和排名前20的KEGG信号通路等数据结果导入Cytoscape 3.8.2软件，构建“山豆根-急性咽炎-有效成分-作用靶点-通路”网络(Fig 7)。该网络有226个节点，其中包括山豆根(红色六边形)，急性咽炎(橙色正方形)，山豆根21个活性成分(紫色V形)，194个山豆根与急性咽炎的共同靶标(绿色菱形)，排名前20信号通路(桃红色三角形)和1 041条边。该网络图直观地体现山豆根通过多成分、多靶点和多通路改善急性咽炎的作用机制。

Fig 2 “Sophora tonkinensis Gagnep-acute pharyngitis-effective components-target”network

Fig 3 Sophora tonkinensis Gagnep to improve potential target interaction network of acute pharyngitis

Fig 4 Horizontal bar chart of core targets

Fig 5 The biological process of GO enrichment histogram in top 10 intersecting targets of Sophora tonkinensis Gagnep and acute pharyngitis

Fig 6 Analysis of top 20 KEGG pathways in intersection target of Sophora tonkinensis Gagnep and acute pharyngitis

2.7 白细胞跨内皮迁移信号通路信号通路基因筛选在筛选的排名前20的通路进行筛选与急性咽炎相关的通路，主要有IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、NF-kappa B 信号通路(NF-kappa B signaling pathway)和白细胞跨内皮迁移信号通路(leukocyte transendothelial migration)等。山豆根中主要活性成分异鼠李素、醉茄素、大豆皂苷E、山奈酚、槲皮素等作用于白细胞跨内皮迁移信号通路11个靶点ITGB1，PRKCA，PIK3CD，PTK2，ITGB2，PRKCB，PTPN11，ITGA4，PIK3CA等。

2.8 山豆根对急性咽炎大鼠体质量及血清IL-6、IL-10、PEG2水平的影响向大鼠咽部喷雾10%的氨水造模观察，模型组大鼠相较空白组活动量减低，毛色无光、行动低迷、精神不振、饮食量减少，说明造模成功；
各给药组大鼠的症状均轻于模型组大鼠。与空白组相比，造模后，模型组大鼠体质量明显降低(P<0.01)，血清 IL-6、PEG2水平明显升高(P<0.01)，IL-10水平明显降低(P<0.01)；
与模型组比较，山豆根低剂量组大鼠体质量明显升高(P<0.05)，山豆根高、中、低剂量组大鼠血清 IL-6水平均明显降低(P<0.01)，山豆根低、中、高剂量组大鼠血清IL-10含量均明显升高(P<0.01)，山豆根低、高剂量组大鼠血清PEG2含量均明显降低(P<0.01或P<0.05)，相较模型组，山豆根低剂量组大鼠血清IL-6、PEG2含量最低，IL-10含量最高(Tab 3)，效果最优。

2.9 大鼠咽部组织病理组织学观察与空白组相比，模型组固有层和黏膜层病理变化明显，炎性细胞浸润明显，固有层有明显的水肿现象，阳性药组固有层和黏膜层无明显病理变化，山豆根低剂量组固有层和黏膜层病理有轻微变化，炎性细胞浸润较轻，固有层水肿现象较轻，山豆根中高剂量组相较模型组固有层和黏膜层病理变化较轻，但相较于山豆根低剂量组病理变化较为严重，山豆根低剂量组咽部组织细胞着色较为均匀，细胞形态基本正常，炎性细胞浸润情况明显减轻(Fig 8)。

Fig 7 “Sophora tonkinensis Gagnep-acute pharyngitis-effective components-target-pathway”network

Tab 3 Comparison of levels of IL-6,IL-10,PEG2 in pharyngeal tissues of

Fig 8 Pathological morphology of pharyngeal tissues of rats(HE staining,×200)KB:blank group；
MX:model group；
YX:positive drug group；
DJ:Sophora tonkinensis Gagnep low-dose group；
ZJ:Sophora tonkinensis Gagnep middle-dose group；
GJ:Sophora tonkinensis Gagnep high-dose group.

2.10 咽部组织ITGA4、ITGB1、ITGB2、PIK3CA、PIK3CD、PRKCA、PRKCB、PTK2、PTPN11 mRNA的表达水平与模型组相比，山豆根低剂量组可明显下调ITGB1、ITGB2、PIK3CA、PIK3CD、PRKCA、PRKCB、PTPN11 mRNA 的表达量(P<0.05或P<0.01)，山豆根低剂量组对ITGA4、PTK2 mRNA的表达无明显影响，与模型组相比，山豆根空白组对ITGB1、PRKCA、PRKCB mRNA 的表达无明显影响(Fig 9)。综上，山豆根可能通过下调ITGB2、PIK3CA、PIK3CD和PTPN11基因表达，从而减轻急性咽炎大鼠的咽部组织的炎症反应。

Fig 9 Expression of leukocyte transendothelial migration genes in pharyngeal 1:blank group；
2:model group；
3:Sophora tonkinensis Gagnep low-dose group.*P<0.05，**P<0.01 vs blank group；
#P<0.05，##P<0.01 vs model group

本研究通过氨水诱导的大鼠急性咽炎模型评价山豆根对咽炎的影响，实验数据显示，山豆根低中高剂量组都可以缓解急性咽炎相关症状，其中山豆根低剂量组效果最佳，模型组症状如减少饮食，减少活动量，口腔抓挠，咳嗽，唾液分泌，咽部肿胀[11]，山豆根低剂量组则症状较轻，还可以减轻黏膜增生，细胞浸润和血管扩张等(Fig 8-DJ)。提示山豆根能有效改善氨水导致的急性咽炎大鼠模型。减少腺体肥大和粘膜增厚的发生，减轻氨性咽部相关症状。

本实验数据显示，氨水喷洒可逆转组织损伤所诱导的促炎细胞因子IL-6的上调。山豆根降低COX-2和5-LOX的表达，进一步减少炎性细胞因子PGE2的产生。作为促炎和炎症细胞因子(白细胞介素-6)产生的主要调节因子，白细胞跨内皮迁移信号通路的激活是宿主细胞对氨诱导的组织损伤反应的标志。目前研究表明，山豆根可通过激活白细胞跨内皮迁移信号通路，减轻组织损伤所致的咽炎大鼠炎症反应[11]。

炎症是身体组织对有害刺激(如病原体)的复杂生物反应的一部分。它是一种保护性反应，涉及白细胞、血管和分子介质，目的是消除细胞损伤的最初原因，并启动组织修复。炎症受到身体的严格调控，与白细胞短暂穿过血管壁有关，这一过程被称为跨内皮细胞迁移(TEM)。白细胞的外渗是(病理)生理过程所必需的，包括T淋巴细胞的迁移以进行免疫监视，急、慢性炎症反应中活化的淋巴细胞和粒细胞的募集，以及造血祖细胞的归巢和动员[12]。

编码β-2整合素家族的ITGB2基因介导白细胞与内皮细胞的黏附和向炎症部位的迁移，此外，它还参与了中性粒细胞的细菌识别和由外向内的信号传递[13]，受影响患者的突出临床特征是反复的细菌感染，主要局限于皮肤和黏膜表面，就好像急性咽炎中咽部的红肿热痛等。细胞的增殖、存活、分化、迁移和凋亡等过程都受酪氨酸磷酸化的调控，酪氨酸磷酸化又受蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)的调控，调节着多种细胞过程。PTKs的表达改变和突变与多种形式的癌症和炎症有关[14]。从以往来看，PTP被视为负面调节因子，因为它们有能力逆转PTK的影响，PTK通常启动信号级联反应。炎症是蛋氨酸的表型特征之一，几个基因变异在表型上表现出多效性的遗传关联，而其中PTPN11是几个变异基因中的一个。PI3K是一类脂质激酶，在控制细胞增殖、细胞死亡、运动和细胞入侵等信号通路中起重要作用。PIK3CA或PIK3CD的基因扩增可诱导白细胞跨内皮迁移信号通路的下游激活。活跃的白细胞跨内皮迁移信号通路的作用被认为与炎性微环境有关[15]。白细胞跨内皮迁移信号激活与微环境中炎症细胞(如CD8中T淋巴细胞)的聚集有关，而环氧合酶2(通常也存在于该途径的激活)可以调节PEG2的合成，导致某些T细胞通过其PEG2受体聚集[16]。山豆根明显降低ITGB2、PIK3CA、PIK3CD和PTPN11基因的表达水平，涉及白细胞跨内皮迁移等途径的关键基因，抑制炎症的发生,对氨性急性咽炎起到保护的作用。

山豆根还可能通过与靶点结合抑制人白细胞分化抗原的表达，抑制Toll样受体4信号通路、NF-kappa B信号通路和有丝分裂素激活蛋白激酶信号通路，抑制促炎介质的产生，白细胞跨内皮迁移通路介导了NF-kappa B通路的激活[17]，NF-kappa B信号通路是细胞中重要的转录调节通路，作为炎症发生的一条重要途径，是炎症和抗炎的核心，是参与机体炎症反应的主要通路之一[18]。山豆根中ATF3不仅阻止NF-kappa B与促炎症细胞因子的基因启动子的结合，而且还可以通过与NF-kappa B的p65亚单位的直接物理结合来阻止NF-kappa B的转位进入细胞核。因此，山豆根可能调控NF-kappa B信号通路从而产生抗急性炎作用，包括在氨性刺激后观察到的抗急性咽炎作用。因此，山豆根可能抑制了NF-kappa B的转位，并在转录水平上抑制了致炎细胞因子的表达[4]。

综上所述，山豆根低剂量组具有明显的抗炎作用，保护黏膜组织完整性，改善咽炎症状。山豆根能够降低炎症因子的含量，减少氨性损伤大鼠的促炎细胞因子和炎性介质的表达有关。山豆根可抑制白细胞跨内皮迁移通路关键基因表达，减轻急性咽炎造成的炎细胞浸润。山豆根作为一种治疗咽炎等上呼吸道炎症的药物可能具有很大的临床潜力。

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