乳清发酵粉对鲜湿河粉贮存过程中微生物的影响研究

◎周 玥，董建华，王海银，郑柏根，郭慧青，潘建泽，李超文

（1.上海奕农生物科技有限公司，上海 201400；
2.广州海有生物科技有限公司，广东 广州 510000）

清洁标签的食品趋势起源于英国，后逐渐扩大到整个欧盟。清洁指的不只是表面上的干净，重点是产品配料里尽量使用简单纯粹的成分，以自然萃取的添加剂取代人工合成的添加剂[1]。当前食品行业主要的防腐产品为化学合成防腐剂，如脱氢乙酸钠、苯甲酸钠等。但因化学防腐剂毒性较高，近年清洁标签配料的保鲜产品越来越受消费者欢迎[2]。目前，国际上主要的清洁标签保鲜公司有杜邦MicroguardTM、建明公司、Kerry 公司，但因其添加量大、价格高等原因，在中国市场发展缓慢[3]。

乳清发酵粉是以葡萄糖、乳清粉、酵母抽提物等作为原料和辅料，经食用菌种发酵等加工工序制成的产品[4]，2019 年被国家卫生健康委员会审批为新食品原料，其中的有机酸和小分子肽可抑制微生物，对食品保鲜具有重要作用[5]。乳清发酵粉产品作为进口清洁标签保鲜产品的替代产品，具有性价比高、效果好等优点，对食品保鲜行业发展具有积极的推动作用。

鲜湿河粉是以大米为主要原料，经切粉工艺得到的条状制品[6]。因鲜湿河粉含水量高达60%，且营养丰富，极利于微生物生长，故如何控制湿河粉中的微生物对延长其保质期具有重要作用。添加保鲜剂是常见的抑制微生物的方法。

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）是1977 年在东北酵米面中毒事件中发现的食物中毒菌[7]，该菌引起的食物中毒多与某些地方特色食品有关。由此可见，在湿河粉中控制唐菖蒲伯克霍尔德菌的生长对于食品安全具有重要意义。

综上所述，鲜湿河粉的品质控制和安全生产成为亟待解决的问题。鲜湿河粉的保鲜关键是防止微生物引起腐败。本课题主要研究乳清发酵粉对鲜湿河粉在贮藏过程中微生物的抑制效果，综合评价生物发酵源产品——乳清发酵粉对鲜湿河粉保鲜的作用，为鲜湿河粉保鲜研究提供一定依据。

1.1 主要材料和试剂

大米为市购；
小麦淀粉购自鹤壁仁合粉业有限公司；
乳清发酵粉购自上海奕农生物科技有限公司；
营养琼脂培养基、孟加拉红培养基均购自广东环凯科技有限公司；
其余化学试剂购自上海麦克林生化科技有限公司。实验中所用到的设备有磨浆机、蒸箱、高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、自动称量分注仪、显微镜、电子分析天平、均质拍打机、振荡器、无菌培养皿和移液枪等。

1.2 体外测试乳清发酵粉对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的抑菌效果

配制PCA 培养基、纯水、0.85% 生理盐水，121 ℃ 20 min 灭菌后备用。称取一定量的乳清发酵粉于无菌烧杯中，加无菌纯水溶解后备用；
移取用LB 肉汤活化14 h 的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌培养液0.1 mL至生理盐水中配制成菌悬液，用10 倍梯度稀释法测菌悬液浓度，将菌悬液浓度稀释至5-l gCFU/ml。分别移取1 mL 菌液和所需乳清发酵粉溶液至无菌培养皿中，注入20 mL PCA 培养基，迅速摇匀后，冷却待凝结，倒置36 ℃培养48 h，定期观察菌落生长情况。

1.3 用于反接菌添加乳清发酵粉鲜湿河粉的制作

称取大米500 g，加自来水800 g 浸泡2 h，磨浆后加入小麦淀粉210 g，加自来水至2 500 g。按米浆的量分别称取0.1%、0.15%、0.2%的乳清发酵粉，搅拌均匀后倒入培养皿中30 g。蒸箱水沸后，将培养皿放入蒸煮9 min 后，盖上培养皿盖，置于灭菌锅中121 ℃灭菌15 min。灭菌完成后迅速将培养皿移至超净工作台内倒置，放至冷却后，倒去冷凝水备用。

1.4 反接试验方法

取1.3 中制备好的鲜湿河粉，在表面均匀涂布0.2 mL 4-lgCFU/ml的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌菌悬液。TTC 溶液能与细菌新陈代谢产生的琥珀脱氢酶反应而显红色，更便于观察菌落。空白湿河粉和添加不同比例乳清发酵粉的湿河粉，在添加菌液后再加入0.2 mL 0.5% TTC 溶液，用涂布棒涂布均匀，放置30 ℃恒温恒湿培养箱。

1.5 添加保鲜剂湿河粉的制作

称取大米500 g，加自来水800 g 浸泡2 h，磨浆后加入小麦淀粉210 g，加自来水至2 500 g。分别添加1.0 g/kg 和1.5 g/kg 乳清发酵粉、0.5 g/kg 和1.0 g/kg 脱氢乙酸钠于米浆中，充分搅拌溶解。倒一定量米浆于蒸盘中，蒸箱水沸后，将装有米浆的蒸盘放入蒸箱中，蒸煮9 min 后从蒸箱中取出冷却20 min，将冷却后的湿河粉置于自封袋中，贮存于36 ℃ 70%湿度的恒温恒湿培养箱中，定期对湿河粉进行菌落总数测试和感官评价。

2.1 乳清发酵粉对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌抑菌效果

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌是对鲜湿河粉的食用安全性威胁最高的菌株。故本研究先在培养基体系中接种定量菌后，研究不同比例乳清发酵粉对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的影响，结果如图1 所示。

由图1 可知，经过一定时间培养后，接种了唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的对照培养皿中长满了肉眼可见菌落，而在添加了0.25 g/kg 的乳清发酵粉培养皿中，肉眼可见菌落数显著降低，说明乳清发酵粉对该菌的生长繁殖具有优异抑制作用。此外，在分别添加0.5 g/kg和1 g/kg 乳清发酵粉的培养皿中，其出现的菌落分别为5 个和0 个，显著低于对照组，并且与添加0.25 g/kg乳清发酵粉的培养皿中菌落数相比也显著下降，说明乳清发酵粉的添加量和其对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌生长繁殖的抑制作用呈现良好量效关系。

图1 乳清发酵粉在培养基体系中对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的抑菌效果图

2.2 乳清发酵粉在鲜湿河粉体系中对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的影响

为进一步测试乳清发酵粉的添加是否可针对性抑制唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的繁殖，于湿河粉中添加TTC 溶液，在30 ℃放置30 h 后，在空白湿河粉上可观察到大量的菌落（图2）。而在添加0.1%乳清发酵粉鲜湿河粉上却未见菌落，说明该菌生长受到了乳清发酵粉的抑制，进一步验证了乳清发酵粉可针对性抑制鲜湿河粉中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长繁殖。

图2 TTC 菌落显色反应图

2.3 乳清发酵粉对鲜湿河粉贮存过程中菌落总数及感官影响

前期实验已证实乳清发酵粉可有效抑制培养基及湿河粉体系中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长繁殖，但在可食用鲜湿米粉中，乳酸发酵粉的抑菌效果及其对鲜湿米粉的感官影响尚未可知。因此，本研究以目前被广泛使用的化学防腐剂脱氢乙酸钠为对照，通过比较分别添加脱氢乙酸钠和乳清发酵粉的河粉在贮存过程中的质量变化，研究乳清发酵粉对鲜湿河粉贮存过程中的微生物生长情况及感官性质的影响，结果如表1 所示。

由表1 可知，未添加任何保鲜剂的鲜湿河粉在贮存12 h后即出现大批微生物生长，感官出现轻微异味，贮存至24 h 时发生明显腐烂现象即产生臭味且颜色变黄。添加了脱氢乙酸钠的河粉与空白组相比菌落总数减少，出现感官异常的时间得到有效延长，且添加比例越高，抑制菌落产生及延缓异味出现的效果越好。但添加0.1%脱氢乙酸钠的鲜湿河粉在贮存至24 h 后颜色明显变暗。

表1 保鲜剂对鲜湿河粉保鲜效果表 CFU/g

与脱氢乙酸钠相比，添加0.1%乳清发酵粉的鲜湿河粉在24 h 并未出现感官异常，且菌落总数与空白组和脱氢乙酸钠组相比显著降低，直至48 h 才产生轻微异味，说明相同添加比例下，乳清发酵粉对鲜湿河粉的保鲜效果优于脱氢乙酸钠。当添加乳清发酵粉比例为0.15%时，即便将鲜湿河粉于36 ℃下贮存48 h仍未发生变质现象。

以上结果说明脱氢乙酸钠和乳清发酵粉对鲜湿河粉均具有保鲜效果，但相同添加量情况下，乳清发酵粉的保鲜综合效果显著优于脱氢乙酸钠，且当乳清发酵粉的添加量为0.1%和0.15%时，可分别将鲜湿河粉的贮存期延长至36 h 和48 h。

随着人们对食品营养和食品安全重视程度的提高，如何在尽可能减少添加剂使用的同时达到食品保鲜的目的，是近年来食品科研工作者研究的热点。具有清洁食品标签的乳清发酵粉在食品相关法律法规中，因其安全性对其添加量未做限制。本研究发现，当乳清发酵粉添加量为0.1%时即可对鲜湿河粉中可引起食物中毒的唐菖蒲伯克霍尔德菌的生长繁殖产生显著抑制作用，这为安全地延长鲜湿河粉货架期提供了参考思路。乳清发酵粉作为具有清洁标签且在食品法律法规中未被限制使用量的产品配料，将其在食品中进行广泛应用仍需进一步尝试与研究。

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