五味子多糖对TGF-β1,诱导的人肾小球系膜细胞炎症因子和细胞外基质FN和COLⅠ表达的影响

刘丽萍 褚福娟 （枣庄市中医医院药剂科，枣庄 277000）

系膜增生性肾炎（mesangial proliferative glomerulo nephritis，MesPGN）是一种肾脏疾病，其特征为肾小球系膜细胞弥漫性增殖、炎症反应和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积累，可能发展为肾小球硬化、肾间质纤维化和终末期肾脏疾病。MesPGN约占中国原发性肾小球肾炎病的60%，是慢性肾脏疾病、慢性肾功能衰竭和尿毒症的主要原因［1］。研究表明，TGF-β1 诱导的肾小球系膜细胞增殖和ECM 积累是MesPGN 最重要的病理变化，随着MesPGN 进程中炎症反应发生，可能进一步加重MesPGN［2］。目前MesPGN 疗法在临床实践中并不理想［3］。因此，需要开发一种新的MesPGN 治疗策略。近年研究表明，五味子在治疗糖尿病肾病和慢性肾炎等疾病中发挥重要作用［4］。五味子多糖（schisandra chinensis polysaccharide，SCP）作为五味子的主要活性成分，具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗糖尿病和抗炎等功效。最新证据表明，SCP能够降低2型糖尿病大鼠血糖，并改善胰岛素抵抗，抑制炎症反应［5］。五味子乙素对糖尿病肾病大鼠肾脏具有保护作用［6］。但SCP 在MesPGN 中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探究SCP对TGF-β1诱导的肾小球系膜细胞炎症反应和ECM 积累的影响，并探究其潜在机制，以期为MesPGN治疗提供新的方向。

1.1 材料 人肾小球系膜细胞购自美国ATCC 细胞库；
SCP 购自中国药品生物制品检定所；
RPMI- 1640 培养液和胎牛血清购自天津博奥赛斯生物科技有限公司；
IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；
MTT 试剂和二甲基亚砜购自美国Sigma 公司；
FN、COL Ⅰ、TLR4、MyD88、NF-κB p65 和p-NF-κB p65 单克隆抗体及二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
SDS-PAGE 凝胶试剂盒购自上海碧云天研究所；
RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green qRTPCR试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒、ECL化学发光检测试剂购自赛默飞世尔科技有限公司；
倒置显微镜购自日本Olympus 公司；
全自动酶标仪购自美国MDC公司；
二氧化碳培养箱购自德国Binder公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组 人肾小球系膜细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中37 ℃常规培养，显微镜下观察细胞生长情况，每2 d更换1次新培养液，细胞贴壁后传代。将对数生长期肾小球系膜细胞随机分为对照（Con）组、模型（TGF-β1）组、SCP低、中、高浓度（SCP-L、SCP-M、SCP-H）组，TGF-β1组细胞采用4 ng/ml TGF-β1 干预48 h，SCP-L、SCP-M、SCP-H 组细胞分别采用200、400、800 µg/L SCP 干预48 h，Con组细胞不做任何处理。

1.2.2 MTT 检测细胞增殖活性 对数生长期肾小球系膜细胞以1.0×104个/孔接种至96 孔板，常规培养，细胞贴壁后按1.2.1 分组处理，各组细胞干预48 h 后分别向各孔中添加5 mg/ml MTT，继续培养 4 h，去培养液，100 µl/孔添加二甲基亚砜，振荡至沉淀完全溶解，全自动酶标仪测定490 nm 处各孔吸光度（OD）值。

1.2.3 ELISA 检测IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 含量 对数生长期肾小球系膜细胞以1.0×104个/孔接种至96 孔板，常规培养，待细胞贴壁后按照1.2.1分组处理，各组细胞干预48 h 后收集上清，IL-6、 IL-1β、TNF-α 和MCP-1 ELISA 试剂盒检测上清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 含量，严格参照ELISA试剂盒说明书操作。

1.2.4 qRT-PCR 检测FN 和COLⅠmRNA 表达 对数生长期肾小球系膜细胞以1.0×104个/孔接种至 96孔板，常规培养，待细胞贴壁后按照1.2.1分组处理，干预48 h 后收集各组细胞，采用RNA 提取试剂盒分别抽提各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA，采用SYBR Green 试剂盒进行qRT-PCR 检测。反应程序：94 ℃ 5 min，40 个循环：94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s。以GAPDH 为内参，2-ΔΔCt分别计算各组细胞FN 和COLⅠ基因相对表达。引物序列为FN F：5"-GATGTCCGAACAGCTATTTACCA-3"，R：5"-CC- TTGCGACTTCAGCCACT-3"；
COL ⅠF：5"-GCTCCT- CTTAGGGGCCACT-3"；
R：5"-CCACGTCTCACCATTGGGG-3"；
GAPDH F：5"-GAATGGGCAGCCGTTAGGAA-3"，R：5"-AAAAGCATCACCCGGAGGAG-3"。

1.2.5 Western blot检测FN、COLⅠ、TLR4、MyD88、 p-NF-κB p65 和NF-κB p65 蛋白表达 对数生长期肾小球系膜细胞以1.0×104个/孔接种至96 孔板，常规培养，待细胞贴壁后按照1.2.1 分组处理，干预48 h 后收集各组细胞，裂解后离心，上清即为总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白含量。沸水浴加热使蛋白变性，等量蛋白上样，行SDS-PAG 凝胶电泳，蛋白分离后转至PVDF 膜，封阻1.5 h，洗膜，浸入1∶800 稀释的FN、COLⅠ、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和NF-κB p65一抗中4 ℃摇床过夜孵育，洗膜，浸入1∶2 000稀释的二抗中孵育2 h，ECL 显影，成像系统获取图像，以GAPDH 为内参，采用Image J 软件分析条带灰度值，分别计算各组细胞FN、COLⅠ、TLR4、MyD88、 p-NF-κB p65和NF-κB p65表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，计量资料采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.1 SCP 对TGF-β1诱导的肾小球系膜细胞增殖的影响 各组细胞培养48 h 后，MTT 检测细胞增殖活性，结果显示，与Con 组相比，TGF-β1 组细胞增殖活性显著升高（P＜0.05）；
与TGF-β1 组相比，随着SCP浓度升高，细胞增殖活性依次降低（P＜0.05，表1）。

表1 各组肾小球系膜细胞增殖活性比较（±s，n=3）Tab.1 Comparison of proliferation activity of glomerular mesangial cells in each group （±s，n=3）

表1 各组肾小球系膜细胞增殖活性比较（±s，n=3）Tab.1 Comparison of proliferation activity of glomerular mesangial cells in each group （±s，n=3）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05；

compared with TGF-β1 group， 2）P＜0.05.

2.2 SCP 对TGF-β1诱导的肾小球系膜细胞炎症因子表达的影响 各组细胞培养48 h 后，ELISA 检测炎症因子表达，结果显示，与Con 组相比，TGF-β1 组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 含量明显升高（P＜0.05）；
与TGF-β1 组相比，随着SCP 浓度升高，炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 含量逐渐降低（P＜0.05，表2）。

表2 各组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1含量比较（±s，n=3， pg/ml）Tab.2 Comparison of levels of inflammatory factors IL-6， IL-1β， TNF-α and MCP-1 in each group （±s， n=3， pg/ml）

表2 各组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1含量比较（±s，n=3， pg/ml）Tab.2 Comparison of levels of inflammatory factors IL-6， IL-1β， TNF-α and MCP-1 in each group （±s， n=3， pg/ml）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05；

compared with TGF-β1 group， 2）P＜0.05.

2.3 SCP 对TGF-β1 诱导的肾小球系膜细胞FN 和COLⅠ mRNA 表达的影响 各组细胞培养48 h 后，qRT-PCR 检测细胞外基质成分FN 和COLⅠ mRNA表达，结果显示，与Con 组相比，TGF-β1 组细胞FN和COLⅠ mRNA表达均明显升高（P＜0.05）；
与TGF-β1组相比，随着SCP 浓度升高，FN 和COLⅠ mRNA 表达逐渐降低（P＜0.05，表3）。

表3 各组细胞FN和COLⅠ mRNA表达比较（±s，n=3）Tab.3 Comparison of expressions of FN and COL Ⅰ mRNA in each group of cells （±s，n=3）

表3 各组细胞FN和COLⅠ mRNA表达比较（±s，n=3）Tab.3 Comparison of expressions of FN and COL Ⅰ mRNA in each group of cells （±s，n=3）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05；

compared with TGF-β1 group， 2）P＜0.05.

2.4 SCP 对TGF-β1 诱导的肾小球系膜细胞FN 和COLⅠ蛋白表达的影响 各组细胞培养48 h 后，采用Western blot 检测细胞外基质成分FN 和COLⅠ蛋白表达，结果显示，与Con 组相比，TGF-β1 组细胞FN和COLⅠ蛋白表达明显升高（P＜0.05）；
与TGF-β1组相比，随着SCP 浓度升高，细胞FN 和COLⅠ蛋白表达逐渐降低（P＜0.05，图1、表4）。

图1 Western blot检测ECM成分中FN和COLⅠ蛋白表达Fig.1 Western blot detection of expressions of ECM components FN and COLⅠ protein

表4 各组细胞中FN和COLⅠ蛋白表达比较（±s，n=3）Tab.4 Comparison of FN and COL Ⅰ protein expressions in cells of each group （±s，n=3）

表4 各组细胞中FN和COLⅠ蛋白表达比较（±s，n=3）Tab.4 Comparison of FN and COL Ⅰ protein expressions in cells of each group （±s，n=3）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05；

compared with TGF-β1 group， 2）P＜0.05.

2.5 SCP 对TGF-β1 诱导的肾小球系膜细胞TLR4/NF-κB 信号通路的影响 各组细胞培养48 h 后，Western blot 检测细胞TLR4/NF-κB 信号通路关键蛋白表达，结果显示，与Con 组相比，TGF-β1 组细胞TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 蛋白表达明显升高 （P＜0.05）；
与TGF-β1 组相比，随着SCP 浓度升高，细胞TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 蛋白表达逐渐降低（P＜0.05，图2、表5）。

图2 Western blot 检 测TLR4、MyD88、p-NF-κB p65 和 NF-κB p65蛋白表达Fig.2 Western blot detection of TLR4，MyD88，p-NF-κB p65 and NF-κB p65 protein expressions

表5 各组细胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65 和NF-κB p65蛋白表达比较（±s，n=3）Tab.5 Comparison of TLR4， MyD88， p-NF-κB p65 and NF-κB p65 protein expressions in each group of cells （±s，n=3）

表5 各组细胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65 和NF-κB p65蛋白表达比较（±s，n=3）Tab.5 Comparison of TLR4， MyD88， p-NF-κB p65 and NF-κB p65 protein expressions in each group of cells （±s，n=3）

Note：Compared with Con group， 1）P＜0.05；

compared with TGF-β1 group， 2）P＜0.05.

MesPGN 是一种常见肾脏疾病，我国20%～40%MesPGN 患者已发展为终末期肾脏疾病［7］。MesPGN主要病理变化为肾小球膜细胞增殖、炎症和ECM 积聚，进而损害肾小球功能。肾小球系膜细胞对维持正常肾小球结构和功能至关重要，主要通过提供正确的机械张力并产生各种细胞因子发挥作用，对调节ECM 转换至关重要［8］。肾小球系膜细胞和肾小管间质ECM 蛋白积累会增强纤维化，是慢性肾脏疾病的标志，也是肾功能不全的主要驱动力。肾功能不全的主要调节因子TGF-β1 是由代谢损伤产生的［9］。已有研究采用TGF-β1 诱导肾小球系膜细胞构建MesPGN 体外细胞模型，探究MesPGN 的发生机制［10］。研究证实，SCP具有多种生理功能，如抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、保肝、降血脂、抗疲劳、抗糖尿病和降血糖、止咳、镇痛和抗衰老［11-12］。SCP 无明显毒性，几乎无副作用，可作为一种安全有效的补充疗法用于多种疾病治疗，包括肾脏疾病［13］。本研究证明SCP 能够减轻TGF-β1 诱导的肾小球系膜细胞炎症反应和ECM积累，表明SCP可能成为MesPGN 的潜在治疗药物。

越来越多的证据表明，肾小球系膜细胞是一种主要的肾脏驻留细胞，且与MesPGN 发生和发展高度相关［14］。肾小球系膜细胞过度增殖是与MesPGN相关病理生理机制的主要因素［15］。已有报道TGF-β1刺激增强肾小球系膜细胞增殖并最终促进肾间质纤维化［16］。与既往研究结论相符，本实验结果显示，TGF-β1诱导的肾小球系膜细胞增殖活性明显升高，但SCP能够降低TGF-β1诱导的肾小球系膜细胞增殖活性。越来越多的证据表明，肾小球系膜中ECM 过度积累与MesPGN 发展密切相关［8］。ECM 由多种细胞外分子组成，胶原蛋白是其中最丰富的成员。TGF-β1在系膜增生性肾炎肾组织中高表达，是肾纤维化的关键标志物。TGF-β1 可上调FN 表达，FN 是ECM 的关键分子，主要在肾纤维化期间合成。大量研究表明，TGF-β1 可能增强COLⅠ和FN 分泌［17-18］。本研究通过检测FN 和COLⅠ反映ECM 表达是基于既往多项研究结果，如YAN 等［18］发现球囊导管在血管内膜损伤后可引起明显内膜增生，增生性内膜COLⅠ和FN表达增加，说明增生性血管内膜ECM 合成增多，进一步促进了血管平滑肌细胞增殖和内膜增生。LI 等［19］研究显示，机械和电联合刺激更大程度上促进COLⅠ和FN 表达增强前成骨细胞ECM 合成。此外，有研究显示，内脂素能够通过上调COLⅠ和FN 表达促进肾小球系膜细胞ECM 表达［20］。这些研究均采用FN 和COLⅠ表达表示ECM表达，因此，本研究同样采用FN 和COLⅠ表达体现ECM 表达。本研究TGF-β1 刺激的肾小球系膜细胞中，发现COLⅠ和FN 表达有明显上升趋势，而SCP能够有效抑制COLⅠ和FN表达，表明SCP能够减少肾小球系膜细胞中TGF-β1 诱导的ECM 积累。过度的炎症反应和ECM 沉积是MesPGN 的关键致病因素。已有文献证明，TGF-β1处理可诱导肾小球系膜细胞中炎症细胞因子产生［21］。与既往研究结果一致，本实验观察到TGF-β1 刺激能够显著促进肾小球系膜细胞增殖，促进炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1 表达，且ECM 积累增加。而SCP 能够有效抑制TGF-β1 诱导的肾小球系膜细胞增殖，降低炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 表达，减少ECM积累。表明SCP 能够通过抑制肾小球系膜细胞增殖、炎症反应和ECM 积累抑制MesPGN 发生和进展。研究表明，通过激活的TLR4/NF-κB 诱导炎症细胞因子表达，诱发炎症反应，参与MesPGN 发病［22-23］。本实验结果显示，TGF-β1 诱导的肾小球系膜细胞中TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 表达明显升高，而SCP 能够有效降低TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 表达。提示SCP 可能通过阻断TLR4/NF-κB 信号通路激活抑制TGF-β1 诱导的肾小球系膜细胞炎症反应和ECM积累。

本研究表明，SCP 能够抑制TGF-β1诱导的肾小球系膜细胞增殖、炎症和ECM 积累，其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关，表明SCP可能成为MesPGN 的潜在治疗药物。但本研究存在一定局限性，未涉及信号传导途径的特异性抑制剂和动物体内实验，因此有必要进一步研究以了解SCP 在MesPGN 中的作用及机制。此外，本研究显示炎症因子表达降低，但是短暂抑制还是消除了炎症反应尚不清楚，后续将对此进行深入探究。

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