混菌发酵对沃柑果酒品质改善作用

陈晓蝶，胡陆军,2, ，曹雨澜，李 丽,2，赵志峰,3

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644005；
2.四川轻化工大学酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川宜宾 644005；
3.四川大学轻工科学与工程学院，四川成都 610000）

沃柑（Orah）是“坦普尔”桔橙和“丹西”红桔的杂交品种。作为一种新兴的晚熟柑橘类品种，沃柑含有丰富的类黄酮、酚酸和维生素等营养物质[1]。此外，沃柑中还含有丰富的橙皮苷，研究证明该物质对治疗动脉粥样硬化有积极帮助[2]，同时沃柑还具有高糖低酸等特点，使沃柑成为一种理想的酿酒原料。利用沃柑酿造果酒，既能提升沃柑的商品附加值，也符合当代年轻人追求健康和低度酒的多元化需求。但是，目前市面上的柑橘类果酒大多利用葡萄酒商业酵母进行酿造[3]，这导致市面上的柑橘类果酒口味单调且缺少其独特的果香味。因此，筛选适合发酵沃柑果酒的菌种是沃柑果酒研究和产品开发的基础。

影响果酒品质的因素有很多，例如工艺参数（例如pH、糖度、发酵温度和发酵时间等）以及菌种产生的风味物质等[4]，其中，风味物质是影响发酵果酒品质的关键因素之一。研究发现非酿酒酵母在发酵过程中可以分泌果胶酶、β-葡萄糖苷酶等多种胞外酶，有助于在发酵过程中改善果酒品质，近年来受到广泛关注[5]。邢晓莹等[6]利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毛榛毕赤酵母（Pichia manshurica）共发酵木枣果酒，发现产生的木枣果酒具有较低酒精度和较高的酯类物质含量，且枣香、酒香愉悦和谐，颜色清透，滋味丰富。

影响发酵果酒品质的另一重要因素为酸度，该物质在一定程度上影响消费者对果酒的喜好程度。近年来，乳酸菌在果酒降酸方面的优势受到广泛关注，乳酸菌在果酒发酵中可以进行苹果酸-乳酸发酵（Malolactic Fermentation，MLF），将口味尖酸的苹果酸降解为口感更为柔和的乳酸，使果酒的口感更加圆润饱满[7]。此外，乳酸菌产生的有机酸还能提高果酒发酵环境中微生物的稳定性，有助于微生物与发酵液相互作用产生更多风味物质，增加令人愉悦的感官特征[8]。目前，酒酒球菌（Oenococcus oeni）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）常被用于果酒的降酸[9−10]，但目前还未见其用于沃柑果酒的发酵。

本研究通过利用酿酒酵母、毛榛毕赤酵母和植物乳杆菌等菌种发酵沃柑，探究不同菌种及组合对沃柑果酒品质的影响，以期改善沃柑果酒的品质，提高沃柑果酒的产品附加值，满足消费者对沃柑果酒口感和风味多元化的需求，为沃柑果酒的品质改善和产品开发提供一定的指导意义。

1.1 材料与仪器

新鲜无损坏的沃柑 宜宾市长宁县果园；
酿酒酵母SCFF205、毛榛毕赤酵母SCFF213、植物乳杆菌SCFF107 保存于四川轻化工大学生物工程学院；
市售果酒酿酒酵母 安琪酵母股份有限公司；
超氧阴离子检测试剂盒、羟自由基清除能力（比色法）检测试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；
无水碳酸钠、磷酸氢二钾等理化试剂 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；
酵母粉、蛋白胨等培养基试剂 均为试剂纯，北京奥博星生物技术有限责任公司；
果胶酶、无水柠檬酸、焦亚硫酸钾等试剂 均为食品级添加剂，日照金禾博源生化有限公司。

WJE-F6榨汁机 宁波沃玛电器有限公司；
MITR-50ATC糖度计、MITR-80ATC酒精计 长沙米琪仪器设备有限公司；
BSP-250生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；
SK210生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司；
UV-1900I紫外可见分光光度计 苏州乌津仪器有限公司；
PhS-10酸度计 成都世纪方舟科技有限公司；
BHS-6数显六孔恒温水浴锅 宁波市鄞州群安实验仪器有限公司；
GI54DWS立式自动压力蒸汽灭菌锅 厦门致微仪器有限公司；
LC1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司；
TSQ 8000气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 沃柑果酒加工工艺 沃柑果酒发酵工艺流程如图1所示。选择新鲜的沃柑，经清洗、去皮、去筋络后榨汁，去掉果渣保留果肉，添加100 mg/L的果胶酶（30000 U/mL），于20 ℃酶解2 h，添加70 mg/L偏重亚硫酸钾，搅拌均匀，并用白砂糖将糖度调至18°Brix，将pH调至3.7[11]，4 ℃冷藏备用。将酵母菌接种于YPD固体培养基，30 ℃培养24 h后，接种于YPD液体培养基中，在30 ℃恒温摇床（220 r/min）培养24 h，活化二次制成酵母种子液，冷藏备用。植物乳杆菌使用相同方法接种于MRS培养基活化两次制备种子液备用。在20 ℃下进行发酵，间隔48 h检测沃柑果酒的糖度、pH、总酸、还原糖等理化指标。以还原糖为主要指标，当还原糖不再变化时或者变化量不明显时视为发酵结束。发酵结束后将发酵果酒进行过滤，置于经巴氏灭菌的发酵罐中，置于4 ℃陈酿。

图1 沃柑果酒发酵工艺流程Fig.1 Technological process of orah fruit wine

1.2.2 实验组合设计 本研究通过前期预实验最终确定酿酒酵母与植物乳杆菌接种比例为2:1，酿酒酵母与非酿酒酵母接种比例为1:1，活化后的菌种按沃柑果汁体积的6%接入1 L沃柑果汁中使其菌种最终浓度为107CFU/mL。JP组为未发酵沃柑果汁；
Aq组采用安琪酵母单菌发酵；
Sc组采用酿酒酵母SCFF205单菌发酵；
Sm组采用毛榛毕赤酵母SCFF 213单菌发酵；
Sk组采用酿酒酵母SCFF205和毛榛毕赤酵母SCFF213混菌发酵；
Zp组采用酿酒酵母SCFF205、毛榛毕赤酵母SCFF213和植物乳杆菌SCFF107混菌发酵。

1.2.3 沃柑果酒理化指标测定

1.2.3.1 基本理化指标测定 参照酒类国际检测分析方法[12]进行沃柑果酒酒精度、总酸、还原糖的测定，pH采用pH计进行测定，理化指标重复测定三次。

1.2.3.2 总酚含量测定 样品中总酚含量的测定方法参照Mohd等[13]的方法，略微修改。分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL浓度为0.1 mg/mL的没食子酸标准溶液，加入2.0 mL福林酚试剂，8.0 mL浓度为60 g/L碳酸钠溶液，混匀，定容至25 mL，25 ℃水浴1.5 h，在760 nm处测定其吸光值。以没食子酸为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求出回归方程及其相关系数。

精确量取稀释样品1 mL，加蒸馏水至10 mL，按上述方法在760 nm处测其吸光值，按标准曲线y=12.699x+0.082（R2=0.9992）计算总酚含量。

1.2.4 沃柑果酒抗氧化性能测定

1.2.4.1 羟自由基清除率测定 按照羟自由基清除能力（比色法）检测试剂盒说明书对样品进行测定。按以下公式计算羟自由基的清除率：

式中：D表示羟自由基的清除率，%；
A2代表测定管吸光度；
A1表示对照管吸光度；
A0代表空白管吸光度。

1.2.4.2 超氧阴离子含量测定 按照超氧阴离子检测试剂盒说明书对样品进行测定。

1.2.5 沃柑果酒风味物质测定

1.2.5.1 有机酸测定 参考Ye等[14]方法测定样品中的有机酸，略有修改。色谱柱：采用Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），VWD检测器检测波长210 nm，流动相A：95%磷酸二氢钾（pH2.4），流动相B：5%甲醇，进样量：15 μL，流速：0.4 mL/min，柱温：25 ℃。

1.2.5.2 挥发性风味物质测定 参考刘琨毅等[15]方法，略微修改。色谱柱：采用SH-Rxi-5Sil MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm。进样口温度：250 ℃；
离子源温度：200 ℃；
接口温度：250 ℃；
以氦气为载气，流速1.5 mL/min，进样量1 μL。进样方式：不分流进样。程序升温：50 ℃保留1 min；
25 ℃/min升至125 ℃；
10 ℃/min升至300 ℃，保留10 min。

1.2.6 感官评价 挑选10名食品专业的同学并进行相关培训，参考王玉霞等[16]的方法对发酵沃柑果酒进行感官品评（表1）。

表1 沃柑果酒感官评价Table 1 Sensory evaluation of orah fruit wine

1.3 数据处理

利用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan法进行差异分析，P<0.05时表示差异显著，采用GraphPad Prism 6.0绘图。

2.1 沃柑果酒发酵过程中基本理化指标变化

2.1.1 pH和总酸 pH和总酸的变化是有机酸不断合成与分解的结果，是表征沃柑果酒品质的重要指标之一，不仅影响沃柑果酒的口感、色泽，而且对发酵过程中微生物的生长代谢有较大影响[17]。五个发酵组总酸和pH的变化如图2所示，在前4 d内各发酵组的pH呈下降趋势，总酸呈上升趋势，除了来自沃柑果浆中的酸性成分外，可能还有酵母细胞生长繁殖自身代谢产酸[18]，以及细胞在高糖的环境下，激发了细胞代谢产酸的应激效应所产生的酸[19]。Sm组的pH最低，可能是因为毛榛毕赤酵母生长及代谢酸的能力不及酿酒酵母[20]。与Sk组、Aq组相比，含有植物乳杆菌的Zp组总酸含量最低为5.34±0.28 g/L，且pH最高为4.01±0.01（P<0.05），可能是因为植物乳杆菌分解苹果酸等大分子酸类物质的能力更强[21]。

图2 发酵过程中pH和总酸的变化（n=3）Fig.2 Changes of pH and total acid during the fermentation process (n=3)

2.1.2 糖度、还原糖和酒精度 酵母菌通过呼吸作用将糖类转变为乙醇及其他次级代谢产物，糖的利用率是衡量酵母菌发酵性能的重要指标之一[22]。由图3可知，不同菌种在单独发酵和混合发酵过程中，糖度和还原糖由于微生物的利用总体上一直呈下降趋势。在发酵前期各组还原糖有小幅上升，可能是沃柑果酒中的果肉在发酵过程中由于浸渍的作用或者是果胶酶对果胶类物质的水解作用而导致还原糖的小幅度升高[23]。在发酵中后期，毛榛毕赤酵母单菌发酵Sm组相比其他发酵组对糖的利用效率最低，发酵末期的还原糖含量最高为34.97±0.74 g/L，而三菌混菌发酵Zp组相比于其他组糖度值和还原糖含量最低（P<0.05），最终含量为2.54±0.02 g/L，表明Zp组发酵速率优于其他组，可能是因为酵母菌释放了一些营养物质，如维生素和氨基酸，促进了毛榛毕赤酵母和植物乳杆菌的生长代谢，提高了该发酵组整体对糖的利用率[24]。

图3 发酵过程中糖度和还原糖的变化（n=3）Fig.3 Changes in sugar and residual sugar content during the fermentation process (n=3)

如图3和图4所示，由糖度、还原糖动态变化图和发酵结束酒精度对比可知，酒精度的大小与糖利用程度关系密切。如图4所示，三菌混菌发酵Zp组对糖的利用率最高，其酒精度也最高为12.40%±0.10%；
单菌Sm组在发酵过程中对糖的利用率相对较低，主要用于生成非酿酒酵母生物量和其他副产物，无法完成糖的充分利用，因此产酒精能力相对较弱[25]，其酒精度最低为6.70%±0.20%。这在一定程度上说明，在利用糖方面，相对于单菌发酵Sm组而言，混菌发酵Sk组和Zp组发酵效率得到显著提升。

图4 不同发酵组酒精度（n=3）Fig.4 Alcohol content of different fermentation groups (n=3)

2.2 抗氧化性分析

总酚是果酒重要的品质参数之一，它可以直接影响果酒的色泽、苦味和涩味，酚类物质的平衡决定了果酒的整体口感[26]。如图5A所示，微生物在发酵过程中合成大量次级代谢产物，与酚类物质发生各种氧化、聚合或沉淀等反应，使得各组发酵后的总酚含量整体下降[27]。由图5B可知，发酵结束后，与沃柑果汁JP组相比，其余各组超氧阴离子含量和羟自由基清除能力显著降低（P<0.05），可能是因为细胞壁吸附了沃柑果酒中的抗氧化物质，或者是在微生物酶的催化下沃柑果肉的细胞壁分解生成蛋白质、糖苷等物质，使沃柑果酒的抗氧化能力有所下降[28]。相对于其他发酵组，Zp组总酚含量最高为279.82±1.36 mg/L，超氧阴离子含量最高为71.23±0.65 μmol/mL，羟自由基清除率最高为70.75%±0.17%。整体来看，Zp组的抗氧化能力显著优于Sk组（P<0.05），这种差异可能是由于植物乳杆菌促进了咖啡酸和根皮苷含量的增加，提高了发酵体系的抗氧化性[7]。

图5 不同发酵组总酚含量、超氧阴离含量和羟自由基清除能力（n=3）Fig.5 Total phenol content, superoxide anion content and hydroxyl radical scavenging ability in different fermentation groups (n=3)

2.3 沃柑果酒不同发酵组风味物质分析

2.3.1 不同发酵组中有机酸比较 有机酸是影响果酒感官品质的另一项重要指标，它不仅影响果酒的酸味和苦涩味，而且果酒的颜色、化学稳定性和储存质量等也与有机酸存在明显的相关性[17]。不同菌种降解和合成有机酸的能力不同，有机酸的变化可能会伴随着某些风味物质的变化，如乳酸乙酯、醋酸酯、挥发性脂肪酸和萜类物质等[29]。由图6可知，乳酸和乙酸是沃柑果酒发酵产生的主要有机酸。酒石酸在所有发酵组中相对含量较少，原因可能是其生成了酒石酸氢钾沉淀[29]。柠檬酸相对含量较少，可能在于微生物在发酵过程中通过柠檬酸代谢生成乙酸、乳酸和2,3-丁二醇等物质[30]。

图6 不同发酵组有机酸含量对比Fig.6 Comparison of organic acid content in different fermentation groups

乙酸是通过磷酸葡萄糖酸途径的醋酸盐激酶途径和柠檬酸的代谢产生的[31]。由图6可知，Sk组和Sm组的乙酸相对含量较高分别为8.99%和7.92%，而Zp组的乙酸相对含量最低为6.82%，可能是因为植物乳杆菌分解沃柑果酒中的己糖，使沃柑果酒发酵更均匀，减少了乙酸的生成[32]。这在一定程度上证明本研究所选择的三个菌种的混菌发酵方式可以减少沃柑果酒不良气味的产生，且加入植物乳杆菌能起到一定的降酸作用。

在发酵过程中，乳酸是糖酵解的最终产物，通过还原丙酮酸或转化苹果酸形成[14]，在口感上比苹果酸更加柔和。由图6可知，除Aq组和Zp组，其余发酵组乳酸的相对含量都比较高。Zp组的乳酸相对含量与Sk组相比略低，说明在相同条件下，植物乳杆菌有一定的降解乳酸的能力，使沃柑果酒整体的酸度降低，口感更加柔和。

综上，Zp组混菌发酵中的各类有机酸含量低于其他发酵组，有机酸含量总和最低为7.9%，与总酸分析结果一致。在一定程度上说明加入植物乳杆菌的混菌发酵有利于降低沃柑果酒的酸度，平衡沃柑果酒的苦涩感，有效提升沃柑果酒的口感。

2.3.2 不同发酵组挥发性风味物质物质比较 发酵菌种是影响果酒挥发性风味物质形成和感官特征的重要因素之一。五组发酵体系中共检测出68种挥发性成分，其中醇类18种、酸类7种、酯类18种、醛酮类6种、包括萜烯类和杂环类物质在内的其他化合物共19种。Sk组和Zp组挥发物种类较多，分别有31和29种。

挥发性脂肪酸是酯类物质的重要前体，适量的酸可以为果酒带来圆润清爽的口感，过量则会导致刺鼻的气味[33]。如表2所示，乙酸、丁酸和己酸是沃柑果酒中最主要的挥发酸，乙酸在果酒中尤为重要，它可以通过乙酰辅酶A作为水果醋酸酯的前体[34]。Zp组的乙酸和总挥发酸相对含量低于Sk组和Sc组，可能是植物乳杆菌分泌脂肪酶等改变了沃柑果酒挥发性脂肪酸的组成[35]。

表2 不同发酵组挥发性风味物质对比Table 2 Comparison of volatile aromatic compounds in different fermentation groups

高级醇也是沃柑果酒香气的重要组成成分，如表2所示，异山梨醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、异丁醇和3-甲基-1-丁醇是沃柑果酒主要的醇类成分。其中苯乙醇和异丁醇在Sk组和Zp组相对含量较高，这些物质赋予沃柑果酒良好的花香和酒香[36]，这为增加沃柑果酒香气复杂性做出一定贡献。此外，2,3-丁二醇在Zp组中相对含量最高，2,3-丁二醇的生成取决于沃柑果酒的氧化还原电位以及NADPH的双乙酰还原酶和丙酮还原酶的活性，有助于增加沃柑果酒的青香味[37]。因此，酿酒酵母、毛榛毕赤酵母和植物乳杆菌共发酵能促进某些高级醇的生成，丰富沃柑果酒的香味。

续表 2

酯类是果酒中的主要呈香物质，主要在发酵和老化期间通过醇类与脂肪酸的酯化作用形成[38]。如表2所示，乙酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯是沃柑果酒的主要酯类，这些酯类赋予沃柑果酒丰富的花香和果香[38]。丁酸乙酯在Sk和Zp组相对含量较高，可能是由于菌种的互补作用提高了酰基转移酶的活性，更有利于酯类物质的积累[39]。乙酸乙酯在各组酯类中相对含量最高，这可能与较高含量的乙酸和乙醇酯化形成乙酸乙酯有关[40]。乳酸乙酯与沃柑果酒的果味、乳白色和口感增加有关，在各发酵组的相对含量相差不大，与乳酸的含量有一定对应关系[34]。

此外，沃柑果酒发酵过程中产生了众多微量但对香气有贡献的化合物。比如在沃柑果酒中检测到多种萜烯，包括单萜烯和倍半萜，这些化合物可通过酵母菌的酸水解或β-葡萄糖苷酶活性释放[41]。芳樟醇、右旋萜二烯和4-萜烯醇是沃柑果酒的主要萜烯，为沃柑果酒带来花香和柑橘香[41]。此外，醛酮类化合物虽然在沃柑果酒中含量较少，但对协调沃柑果酒的香气有较大帮助。在Zp组中检测到2,3-丁二酮，该物质可以提供奶香、苦杏仁等香气[42]。

2.4 沃柑果酒不同发酵组感官评价

沃柑果酒的品质与其色泽、香气、口感等感官指标有关，经过感官品评，混菌发酵的沃柑果酒澄清度、香气、口感持久性和整体可接受性都得到了明显改善（表3）。除Sm组外，各发酵组在口感上得分都较高，说明乳酸和乙酸相对含量虽然较高但还未达到对沃柑果酒造成负面影响的程度。Sk组和Zp组沃柑果酒的色泽和香气得分较高，可能是由于菌种的互补作用减少了某些营养物质的损失从而提高了沃柑果酒的色泽，以及增加了某些酯类、高级醇的积累。特别地，Zp组被认为酸度最低，酒香、花香和奶油味较浓，与前文总酸、有机酸分析结果一致，而酒香、花香和奶油味较浓可能是与某些醇类、酯类物质及2,3-丁二酮有关系[43]。而Sm组在色泽、口感和典型性方面得分较低，总分为70.1±1，可能毛榛毕赤酵母单发酵的能力较弱，导致发酵进程缓慢，营养物质损失较多[44]。综合来看，酿酒酵母、毛榛毕赤酵母和植物乳杆菌混菌发酵Zp组的沃柑果酒颜色鲜艳，香气丰满，口感独特，更受欢迎。

表3 沃柑果酒感官评价得分（分）Table 3 Sensory evaluation scores of orah fruit wine (scores)

本研究首次利用酿酒酵母、毛榛毕赤酵母和植物乳杆菌发酵沃柑果酒，并对比了不同菌种组合的发酵组理化特性、抗氧化性与风味物质。相比于单菌发酵，酿酒酵母、毛榛毕赤酵母与植物乳杆菌混合发酵Zp组理化特性最好，发酵后还原糖含量最低为2.54±0.02 g/L，总酸为5.34±0.28 g/L。而且Zp组抗氧化特性最强，总酚含量最高为279.82±1.36 mg/L，超氧阴离子含量最高为71.23±0.65 μmol/mL，羟自由基清除率最高为70.75%±0.17%。在有机酸和风味物质方面，乙酸和乳酸是沃柑果酒发酵产生的主要有机酸，Zp组有机酸含量最低为7.9%，而且乙酸乙酯、辛酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等酯类物质丰富，有助于提升沃柑果酒的香气复杂性。此外，Zp组还含有丰富的2,3-丁二醇、苯乙醇、异丁醇等高级醇，赋予了沃柑果酒以花香、酒香和果香等积极特征。总体来说，酿酒酵母、毛榛毕赤酵母和植物乳杆菌组合发酵的沃柑果酒颜色清透，香气浓郁，口感酸甜适中。该研究为沃柑果酒品质调控和产品开发提供一定的科学依据。后续还可以针对沃柑果酒的发酵工艺进行优化，进一步探讨不同菌种接种量及其接种顺序等因素对沃柑果酒品质的影响。

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