脐带间充质干细胞在阿尔茨海默病及促神经分化中的研究进展

韩 雪， 王 蕾， 孙 旭， 宁家辉， 衣红杰， 赵 婧

(1.山东中医药大学， 山东 济南 250014 2.山东中医药大学第二附属医院神经内科， 山东 济南 250001)

阿尔茨海默病(AD)早在临床症状出现前就已发生神经病理改变，最终发展为严重的痴呆。间充质干细胞(MSCs)移植治疗技术是近年来新兴的细胞修复治疗技术。脐带间充质干细胞(UC-MSCs)具有多向分化潜能，移植后可改善AD导致的认知功能障碍。可靠的体外诱导方式可以促进MSCs靶向神经元分化，提高生物利用率。本文着重对UC-MSCs的特性和优势、治疗AD可能的机制、体外诱导靶向分化的方式展开综述，旨在为UC-MSCs治疗AD的实验和临床研究提供理论依据，为治疗AD寻找新思路。

当下明确批准治疗AD的药物主要有乙酰胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，但仅可暂时改善症状，对疾病病程没有影响。目前药物开发更多地瞄准疾病修饰疗法，能够延缓AD临床病程甚至逆转认知衰老。近年来靶向菌-肠-脑轴和抗淀粉样单克隆抗体成为研究热点，但长期的疗效和安全性存在巨大争议[1]。研究[2]显示中药也可抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)异常沉积和Tau蛋白过度磷酸化，包括单味中药和复方制剂，但具体机制和毒副作用未阐明。除药物治疗外，非药物治疗轻中度AD也获得极大关注。研究[3]证明运动锻炼对脑功能具有直接的益处，有氧运动可以增加脑血流量，提高氧利用率，改善突触可塑性和促进神经发生，协同认知训练效果更佳，可以涉及记忆、计算、语言等多个领域。感觉刺激包括音乐疗法、芳香疗法、光疗法等，能缓解AD患者的焦虑抑郁情绪，调节睡眠节律，改善认知和行为[4]。此外，针灸、经颅磁刺激等也可改善认知障碍，提高AD患者的日常生活能力。但这些方法治疗效果仍需要大规模数据的支持。总之，目前尚无明确治疗AD的有效方法。近年来大量关注点集中在MSCs移植治疗AD上[5]。

MSCs作为可持续自我更新、增殖分化的干细胞，广泛存在于多种组织，用于神经再生技术的MSCs来源以骨髓、脂肪和脐带研究较多。骨髓间充质干细胞(BMSCs)收集需经骨髓穿刺获取，且一次获得细胞数量有限，具有分化能力强、免疫原性低、伦理问题少等特点。Nakano等[6]通过APP/PS1小鼠脑室内注射BMSCs将外泌体miR-146a转移到星形胶质细胞中，可减轻神经炎症并促进突触发生，改善了学习记忆障碍，但对Aβ聚集和神经元凋亡没有影响。脂肪间充质干细胞(ADSCs)在局麻下吸脂获得，比BMSCs来源更广泛。UC-MSCs来自分娩后废弃的脐带，获取途径方便，对于供体几乎没有创伤，伦理问题更少。黄平等[7]研究表明UC-MSCs较ADSCs对外周血单核细胞的抑制作用更强，同时缺少抗原主要组织相容性复合体Ⅱ和共刺激表面抗原CD40、CD80和CD86，所以在免疫排斥方面优于ADSCs；
在诱导分化方面，Drela等[8]研究表明与BMSCs相比，UC-MSCs维持在更早的胚胎期，旁分泌作用更强，诱导后表现出更高的神经谱系分化倾向；
以上两项实验还表明相同培养条件下UC-MSCs体外增殖率高于BMSCs和ADSCs。相比之下UC-MSCs优势更明显，可能是神经修复治疗更合适的MSCs来源。

3.1提供神经营养因子，促进神经结构的重建:脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)是最常见的神经营养因子，可以促进神经发生和突触形成。BDNF对AD导致的胆碱能神经元丢失及胶质细胞异常激活具有潜在保护作用，增加表达可以减缓AD的病情进展和认知功能下降。刘莎等[9]通过立体定位法将UC-MSCs移植到AD大鼠海马CA1区，BDNF和NGF表达均增加，改善局部微环境，促进神经结构重建。神经营养因子还可以诱导UC-MSCs分化为神经元并促进其成熟。李云逸等[10]研究表明体外过表达NGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的UC-MSCs组较单纯培养基组产生了更多的神经样细胞团块，人重肽神经丝蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达增加，诱导UC-MSCs向神经细胞分化。UC-MSCs移植可提供神经营养因子，增加神经递质表达，营造适合神经元迁移和神经再生的微环境，促进神经元增殖分化。

3.2诱导神经元分化，增强突触可塑性:研究[11]发现Aβ沉积和Tau过度磷酸化引起细胞膜孔隙形成，大量Ca2+内流，破坏细胞钙平衡，氧自由基增加，导致突触丢失、细胞骨架破坏，神经元死亡，参与AD发生。而UC-MSCs可以分化为神经元样细胞，促进突触的重构和神经再生。突触素是突触功能成熟和神经递质释放的重要蛋白，高度参与突触功能和神经可塑性。Doshmanziari等[12]移植UC-MSCs后明显上调突触素和生长相关蛋白-43的表达，大鼠海马区基于新生的轴突神经纤维，可建立更加完善的神经信号传导通路。因此，UC-MSCs能通过表达更高水平的神经元相关基因，分化为特定神经元，修复神经鞘和细胞骨架，恢复突触之间的联系，激活内源性神经发生，重建大脑损伤的神经功能回路。

3.3减轻神经炎症，诱导胶质细胞清除功能:神经炎症是AD的发病机制之一。小胶质细胞可以表达经典激活“促炎”(M1)表型和交替激活“抗炎”(M2)表型。Aβ异常沉积可以触发先天免疫反应，结合小胶质细胞上的模式识别受体，M1表型表达增加，M2表型的免疫调节和修复作用受到抑制，释放炎症介质，导致AD进展。Xu等[13]研究显示UC-MSCs通过调节小胶质细胞自噬相关蛋白和增强Aβ降解酶表达，保护小胶质细胞和神经元免受Aβ的神经毒性侵害，促进Aβ被吞噬，防止细胞凋亡。综上，UC-MSCs移植通过交替激活小胶质细胞来调节炎性细胞因子的分泌，抑制神经炎症，分泌Aβ蛋白水解酶，进一步恢复组织稳态，改善AD患者的大脑微环境。

MSCs的神经元分化潜能是治疗AD最有希望的修复机制。但MSCs移植后多分布在肺脏、肝脏等，细胞存活率低，且受自身多种分化潜能的影响，能特异性分化为神经细胞的MSCs也非常有限。因此如何提高MSCs的生物利用率，促进向神经元靶向分化、提高新生神经细胞的成熟率及存活率成为研究热点。

4.1化学诱导剂:最早的诱导方案就是使用化学混合物，如β-巯基乙醇、二甲基亚砜等。刘雨思等[14]取P3代UC-MSCs加入β-巯基乙醇和胎牛血清进行预诱导，加入二甲基亚砜和丁羟基茴香醚正式诱导后发现胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、NSE及微管相关蛋白表达阳性，GFAP是星形胶质细胞标志物，表明UC-MSCs可以分化为胶质细胞和神经元。使用化学剂诱导速度快，分化明显，但是会对细胞产生毒性作用，同时有些学者认为该方法导致的细胞形态改变可能是应激反应，不是真正向神经元分化，可能不适合体内移植[15]。

4.2神经营养因子:目前最常用的诱导方案是采用具有神经功能的细胞因子与MSCs结合。神经营养因子是一种小分子蛋白，对细胞损伤小，安全性相对较高，经常被添加到培养液中以促进神经干细胞分化，如bFGF、BDNF、NGF、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)等。bFGF和EGF是使用频率最高的神经诱导因子。bFGF是广谱的神经营养因子和促有丝分裂因子，除了促进干细胞增殖外，还可决定其分化方向，与EGF协同可以促进神经元存活和分化。MSCs表达TrkA和TrkB受体，BDNF与细胞膜上受体结合，激活一系列细胞生物学反应，促进MSCs向成熟神经元分化。但神经因子分子量小，半衰期短，易代谢，直接注入体内难以满足治疗需求。因此，需建立一种有效、持续释放细胞因子的方法提高分化效率。目前基因转染技术可以帮助解决这一问题，体外转染神经因子质粒进入MSCs，不断分泌细胞因子以实现自我诱导。IGF-1是一种促生长肽，参与中枢和外周组织的分化和增殖，在生长、发育和衰老中发挥作用。综上，将干细胞与相关神经因子相结合的方法似乎更有前途。

4.3中药分子:目前可以诱导MSCs神经分化的中药分子有银杏叶提取物、黄连素、黄芪甲苷等。闫冬冬等[16]在UC-MSCs培养基中加入不同浓度黄连素诱导液，80%以上细胞特异性表达巢蛋白、NSE、GFAP，证实了黄连素的神经诱导作用，且发现100μg/mL浓度组诱导效果最明显，UC-MSCs存活时间最长。詹吉恒等[17]研究显示虎杖苷联合生长因子(bFGF+EGF+BDNF)组较单纯生长因子组诱导MSCs神经分化作用更强，提示中药联合生长因子共同诱导效果会更显著。

4.4生物活性纳米材料:目前常用的生物活性纳米材料有石墨烯、金纳米、硒等。纳米颗粒是一种可以穿越血脑屏障的微观颗粒，副作用少，近年来纳米技术已成为一种提高治疗效率的生物医学方法。壳聚糖是一种天然聚合物，具有促进神经再生的潜力。在体外用纳米颗粒将细胞外基质制造成3D支架结构，可促进细胞附着和存活、神经元分化和轴突生长，能够更好地模拟体内的微环境，保持细胞活力，优点是低细胞毒性、良好的生物相容性等特点。

综上所述，UC-MSCs的特性和优势使其具有治疗潜力，在促神经再生、提高神经营养因子和减轻神经炎症等方面发挥神经保护作用，体外诱导神经分化可以提高细胞生物利用率，在治疗AD方面取得了一些进展。

迄今为止，尽管UC-MSCs的基础研究取得了可喜成果，但临床应用仍处于初级阶段，UC-MSCs发挥神经保护作用的相关机制尚不十分明确。由于标准的实验室模型无法准确模拟人类体内微环境，所以UC-MSCs移植存在一定的局限性和不确定性，在提高生物安全性避免移植后排斥反应、实现UC-MSCs靶向神经元分化并迁移到损伤部位、提高细胞在体内存活和再生等方面还需进一步研究，在移植途径、移植数量、移植频率、治疗周期等方面缺乏高效安全的移植流程，不能确定体外诱导神经分化的可靠方式。在未来的研究中，基因修饰和生物工程方法可能为解决这些问题提供机会，使UC-MSCs成为临床治疗AD的有效选择之一。

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