频复发肾病综合征患儿外周血记忆B细胞亚群分布变化

袁文君 程巾 刘春梅 刘君晗 石梦月 陆书文 关凤军

（徐州医科大学附属医院儿科，江苏徐州 221000）

原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是儿童常见的肾小球疾病之一，微小病变型是其最常见的病理类型。初发微小病变型PNS患儿主要应用糖皮质激素（glucocorticoid，GC）治疗，70%～90%的患儿对GC敏感，但其中约50%患儿表现为频复发肾病综合 征 （frequently relapsing nephrotic syndrome，FRNS）［1］。频繁复发会对PNS患儿长期预后产生不良影响，但其发生机制仍不清楚。

B细胞清除剂利妥昔单抗（rituximab，RTX）治疗可显著降低FRNS患者的复发率，提示B细胞可能在FRNS患儿的疾病发生、发展中发挥了重要作用［2］。但是，我们在临床上观察到，部分FRNS患儿经RTX治疗后，即便外周血B细胞数目已经恢复正常，仍能保持长久无复发；
而一些患儿即使外周血B细胞数量被清除至极低水平（<5%），仍不能获得临床缓解。因此，虽然临床上常通过监测总B细胞数目来确定进一步的治疗，但其并不能作为真正反映PNS临床疾病活动的有效指标。

与GC治疗相似，部分FRNS患儿在RTX治疗后，疾病仍会复发，其中伴随记忆B细胞在RTX介导的B细胞耗竭期发生迅速重建［3-4］。前期我们课题组研究也发现，总记忆B细胞数量在FRNS患儿活动期显著增高，与疾病活动相关［5］。以上证据提示，记忆B细胞可能在FRNS患儿疾病活动中发挥了重要作用，而监测记忆B细胞亚群可能有助于预测PNS的复发，有助于指导再次用药时间。然而，记忆B细胞和其不同亚群在GC治疗PNS患儿前后的变化，以及其与FRNS患儿疾病复发的临床相关性尚未见报道。

因此，在本研究中，我们应用流式细胞检测技术，分析了FRNS患儿在GC治疗前后外周血记忆B细胞亚群的分布变化，进一步探索记忆B细胞在预测PNS患儿GC治疗后复发的临床价值。

1.1 一般资料

前瞻性选择2020年10月—2021年10月就诊于徐州医科大学附属医院儿科的初发PNS患儿35例，根据GC治疗后的反应及复发频次，分为FRNS组（20例）、非频复发肾病综合征（non-frequently relapsing nephrotic syndrome，NFRNS）组（15例）；
另选择同期15例健康体检儿童为健康对照组。PNS诊断符合中华医学会儿科学分会肾脏学组发布的《儿童激素敏感、复发/依赖肾病综合征诊治指南（2016）》的标准［6］。排除标准：（1）有肾脏病家族史；
（2）患有自身免疫性疾病、内分泌疾病及恶性肿瘤等继发性因素；
（3）应用过免疫抑制剂；
（4）GC耐药者。FRNS组男15例，女5例，平均年龄（6.7±2.5）岁；
NFRNS组男10例，女5例，平均年龄（7.2±2.0）岁；
健康对照组男9例，女6例，平均年龄（6.9±2.6）岁；
三组患儿的性别 （χ2=0.976，P=0.642）、 年 龄 （F=0.067，P=0.935）比较差异均无统计学意义。所有患儿家长均知情同意，本研究已获徐州医科大学医学伦理委员会批准（XYFY2022-KL136-01）。

1.2 治疗及疗效判定

PNS患儿确诊后在诱导缓解阶段给予泼尼松2 mg/(kg·d)，分3次口服；
待尿蛋白转阴后，每晨顿服，共4周；
巩固维持阶段泼尼松2 mg/(kg·d)，隔日晨顿服，维持4周，逐渐减量，总疗程12个月。完全缓解以实验室检查正常、临床症状消失为标准。在患儿达到完全缓解后1周复查各项指标。

PNS复发的诊断标准：连续3 d，晨尿蛋白由阴性转为（+++）~（++++），或晨尿的尿蛋白/肌酐 （mg/mg） ≥2.0，或24 h尿蛋白定量≥50 mg/kg。NFRNS：首次完全缓解后半年内复发1次，或1年内复发≤3次。FRNS：经GC标准疗程治疗后缓解，但病程中半年内复发≥2次，或1年内复发≥4次［7］。

1.3 流式细胞术检测记忆B细胞亚群

所有患儿入院第2天清晨采取静脉血1 mL，取1根流式管，加入全血300 μL，磷酸盐缓冲液2 mL，洗涤2次。依次向流式管内加入BV510标记的抗人CD20单克隆抗体（302340）、BV650标记的抗人CD19单克隆抗体（563226）、PE标记的抗人CD27单克隆抗体（302842）、APC标记的抗人IgM抗体（314546）、Alexa Fluor 700标记的抗人IgD抗体（561302）、Percp‑cy7抗人IgE抗体（325510）、BV421标记的抗人IgG抗体（5625581）；
室温避光孵育15 min。每管加入磷酸盐缓冲液2 mL，2 500 r/min，离心2 min，洗涤1次。加入红细胞裂解液2 mL，室温避光裂红8 min，上机检测。上述单克隆抗体均购自上海优宁维生物科技股份有限公司，LSRFortessaTM型流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司，采用流式细胞分析软件FlowJo v10.8.1进行分析处理。

1.4 统计学分析

应用IBM SPSS 26.0统计软件进行数据处理。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组治疗前后比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法；
不符合正态分布的计量资料用中位数（四分位数间距）［P50（P25，P75）］表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，组间两两比较采用Bonferroni法。计数资料采用例数和百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验。采用Pearson相关分析评估两变量间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 GC治疗前各组记忆B细胞亚群表达情况比较

FRNS组及NFRNS组总B细胞、总记忆B细胞、IgD+记忆B细胞、IgE+记忆B细胞比例均较健康对照组增高，且FRNS组较NFRNS组增高更为明显（P<0.05）。FRNS组类别转换记忆B细胞较NFRNS组及健康对照组降低（P<0.05）。三组IgM+IgD+记忆B细胞、IgM+记忆B细胞、IgG+记忆B细胞比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图1、表1。

表1 FRNS组、NFRNS组GC治疗前与健康对照组记忆B细胞亚群水平比较 （± s，%）

表1 FRNS组、NFRNS组GC治疗前与健康对照组记忆B细胞亚群水平比较 （± s，%）

注：a示与健康对照组比较，P<0.05；
b示与NFRNS组比较，P<0.05。［NFRNS］非频复发肾病综合征；
［FRNS］频复发肾病综合征。

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图1 流式细胞术分析图 A门为淋巴细胞，B门为总B细胞（CD19+），C门为总记忆B细胞（CD19+CD27+），Q1为IgD+记忆B细胞 （CD19+CD27+IgD+IgM-），Q2为 IgM+IgD+记忆 B细胞 （CD19+CD27+IgM+IgD+），Q3为IgM+记忆B细胞（CD19+CD27+IgM+IgD-），Q4为类别转换记忆B细胞（CD19+CD27+IgM-IgD-），D门为IgG+记忆B细胞（CD19+CD27+IgG+IgM-IgD-），E门为IgE+记忆B细胞（CD19+CD27+IgE+IgM-IgD-）。

2.2 GC治疗后各组记忆B细胞亚群表达情况比较

FRNS组及NFRNS组总B细胞、总记忆B细胞、IgE+记忆B细胞、IgD+记忆B细胞、IgG+记忆B细胞比例较治疗前降低（P<0.05），与健康对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。IgM+IgD+记忆B细胞、IgM+记忆B细胞较治疗前降低，且低于健康对照组（P<0.05）。类别转换记忆B细胞较治疗前增高，且高于健康对照组（P<0.05）。FRNS组与NFRNS组各B细胞亚群比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2~3。

表2 FRNS组、NFRNS组GC治疗后与健康对照组记忆B细胞亚群水平比较 （± s，%）

表2 FRNS组、NFRNS组GC治疗后与健康对照组记忆B细胞亚群水平比较 （± s，%）

注：a示与健康对照组比较，P<0.05。［NFRNS］非频复发肾病综合征；
［FRNS］频复发肾病综合征。

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表3 FRNS组、NFRNS组GC治疗前后记忆B细胞亚群水平比较 （± s，%）

表3 FRNS组、NFRNS组GC治疗前后记忆B细胞亚群水平比较 （± s，%）

注：［NFRNS］非频复发肾病综合征；
［FRNS］频复发肾病综合征。

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2.3 三组患儿治疗前临床指标的比较及相关性分析

FRNS组尿蛋白定量高于NFRNS组及健康对照组（P<0.05）。FRNS组白蛋白水平低于健康对照组（P<0.05），与NFRNS组比较差异无统计学意义（P>0.05）。三组肌酐及尿素水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

表4 三组患儿GC治疗前临床指标水平比较

类别转换记忆B细胞比例与尿蛋白定量呈负相关（r=-0.512，P=0.021），IgE+记忆B细胞比例与尿蛋白定量呈正相关（r=0.571，P=0.009），见图2。总B细胞、总记忆B细胞、IgD+记忆B细胞、IgM+IgD+记忆B细胞、IgM+记忆B细胞、IgG+记忆B细胞比例与尿蛋白定量无相关性（分别r=0.209、0.172、0.126、0.101、0.250、0.244，P>0.05）。

图2 类别转换记忆B细胞、IgE+记忆B细胞与尿蛋白定量的相关性分析

随着B细胞耗竭疗法在PNS中的成功应用，B细胞在其发病机制中的作用逐渐被认识。而记忆B细胞在B细胞耗竭期的重建，与PNS复发显著相关。记忆B细胞与初始B细胞相比，更易活化，一旦再次遭遇同一特异性抗原，迅速活化、增殖，产生高亲和力特异性抗体［8］。记忆B细胞常通过肿瘤坏死因子超家族成员CD27的表达来鉴定，主要包括3种类别转换前记忆B细胞（IgM+IgD+、IgM+IgD-和IgD+IgM-）和类别转换的IgM-IgD-表型（IgG、IgA或IgE）［9］。已证实在不同疾病中，记忆B细胞的比例与疾病活动程度和治疗反应相关。研究发现，IgA肾病患儿外周血类别转换前记忆B细胞显著增高，且与尿蛋白水平呈正相关［10］；
系统性红斑狼疮患儿外周血中类别转换记忆B细胞比例的增加，与患儿对免疫抑制剂的治疗不敏感有关［11］。在心脏移植、造血干细胞移植及血液透析患者中，类别转换记忆B细胞比例减少显著增加感染概率［12-14］。类别转换前记忆B细胞以T细胞非依赖抗原的方式，分泌IgM抗体，而类别转换记忆B细胞以T细胞依赖方式，在T细胞的辅助下分泌高亲和力IgG抗体［15］。

本研究显示，FRNS组患儿初次发病总B细胞、记忆B细胞比例显著高于NFRNS组及健康对照组，提示FRNS患儿体内存在B细胞、记忆B细胞的异常活化，与Colucci等［16］、Ling等［17］研究一致；
我们进一步分析了记忆B细胞功能亚型，发现FRNS组患儿在初发时，类别转换前IgD+记忆B细胞比例增加，类别转换记忆B细胞比例降低，这与刘光磊等［18］研究结果一致。而研究发现，PNS患儿在初发期记忆B细胞增高，以类别转换记忆B细胞增高为主，应用RTX后，类别转换记忆B细胞的恢复可以预测疾病复发［3-4］。分析有以下两个原因：一方面该研究是在患儿应用RTX后，检测其外周血淋巴细胞亚群情况，而免疫抑制剂的应用可能会影响其原有记忆B细胞分布情况；
另一方面我们将类别转换前IgM+记忆B亚型细分为IgM+IgD+、IgM+IgD-和IgD+IgM-3个亚型，而先前的研究并未细分此亚群。Geisberger等［19］研究显示，IgD+记忆B细胞在遇到抗原刺激时能够通过调节B细胞信号强度，提高阴性选择的阈值。综上，推测患儿类别转换记忆B细胞的减少，可能与IgD+记忆B细胞提高了记忆B细胞的阴性选择，使其向IgM-IgD-转换降低有关。类别转换记忆B细胞能够提高机体对异种抗原的清除能力，降低机体感染风险。而感染是PNS患儿复发的常见原因之一，因此我们推测FRNS患儿频复发可能与其外周血类别转换记忆B细胞减少，潜在感染风险增加有关。

在类别转换记忆B细胞的基础上，我们进一步将类别转换记忆B细胞分为IgE+和IgG+记忆B细胞亚群，发现FRNS组患儿初发时，IgE+记忆B细胞比例显著高于NFRNS组及健康对照组，且IgE+记忆B细胞与尿蛋白定量呈正相关。临床研究也发现，50%~70%的PNS患儿外周血总IgE升高，并出现多种特应性疾病的表型，而接触过敏原也常常与复发相关［20］。过敏性疾病与PNS之间存在共同的发病机制［21］。在调节IgE合成、促进B细胞增殖分化中，表达于活化的B淋巴细胞的跨膜糖蛋白CD23发挥了重要作用，它易被蛋白水解酶裂解为可溶性CD23［22］。我们前期研究发现FRNS患儿在疾病活动期可溶性CD23显著升高［23］，因此，我们推测患儿IgE+记忆B细胞的增高，可能与患儿体内存在B细胞的异常活化及可溶性CD23异常高表达有关。

为进一步了解缓解期两组患儿记忆B细胞亚群是否存在差异，我们分析了GC治疗后两组记忆B细胞的分布情况。两组IgM+IgD+记忆B细胞、IgM+记忆B细胞较治疗前降低，均低于健康对照组；
类别转换记忆B细胞高于健康对照组。提示即使是在缓解期，PNS患儿的部分记忆B细胞亚群也未能恢复至正常水平，这与PNS疾病活动可能密切相关。

综上所述，FRNS患儿存在记忆B细胞亚群的分布异常；
IgE+记忆B细胞和类别转换记忆B细胞比例可作为FRNS患儿在GC干预后复发的正相关和负相关因素。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突关系。

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