视网膜损伤：外泌体转录组学的研究进展△

张 妍 邵正波

遗传、年龄、糖尿病、缺氧、高血压等多种因素可造成视网膜损害，引起患者严重的视力下降甚至失明[1-2]。研究发现，外泌体可通过多种途径调控视网膜损伤及修复，外泌体是一种大小为40～160 nm的细胞外囊泡，可由间充质干细胞、神经细胞、癌细胞等多种细胞分泌形成，广泛分布于羊水、胆汁、母乳、唾液、尿液、泪液等体液中[3-4]。作为一种脂质双分子层结构的囊泡，主要由细胞内多泡体与细胞膜融合后以囊性小泡的形式被释放到细胞外形成[3]。外泌体是细胞间信息交流的重要载体，其中包含的DNA、RNA、蛋白质、脂类等多种生物活性物质均可被其递送到靶组织，参与细胞的增殖、凋亡、迁移等生命活动[3，5-12]。作为纳米级的生物膜结构，外泌体能较好地保护微小RNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)等转录产物的完整性和生物活性，该特征极大地提升了外泌体RNA作为疾病相关生物标志物的可行性[6]。随着对外泌体研究的深入，外泌体中的转录产物，如miRNA、circRNA等在视网膜损伤相关疾病中具有生物学特性和靶向特异性，与疾病发生发展及转归机制密切相关[6]。

转录组学分析是一种应用广泛的研究方法，通过分析特定生理和病理状态下细胞或组织中所有RNA的表达情况，包括可翻译成蛋白质的编码RNA和参与转录调控的非编码RNA，以筛选可能导致生理变化和疾病进展的关键分子[13]。转录组学研究常用的方法包括差异表达分析、聚类分析等，可用于评估不同条件下基因转录丰度的变化、识别共调控基因，从而了解疾病相关的生物机制或途径[13]。因此，利用转录组学分析来研究外泌体中差异表达的RNA，对识别糖尿病视网膜病变(DR)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、青光眼等疾病的分子生物标志物及治疗靶点至关重要[3，9-10，14-16]。

1.1 外泌体转录组学与视网膜色素上皮细胞视网膜色素上皮(RPE)细胞外泌体miRNA可以参与增生型视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿(DME)等疾病的进展过程。Zhang等[17]利用比较转录组学从人视网膜上皮细胞系(ARPE-19)细胞以及上皮-间充质转化(EMT)状态ARPE-19(EMTed ARPE-19)细胞的外泌体中鉴定出了34种有显著表达改变的miRNA，这些miRNA可以调控细胞或组织的EMT，其中miR-543在EMTed ARPE-19细胞源性外泌体中的表达量显著增加，通过介导EMT级联反应导致RPE细胞转分化为肌成纤维细胞，参与增生型玻璃体视网膜病变增殖膜形成，最终导致疾病快速进展。Dong等[18]基于该研究发现，miR-4488和miR-1273g-5p过表达的外泌体可以通过靶向调节三磷酸腺苷结合盒转运体A4(ABCA4)的表达，抑制转化生长因子(TGF)-β2诱导的ARPE-19细胞EMT。上述研究表明，外泌体miRNA对EMT的调控机制尚不明确，仍需进一步研究。随后，Li等[19]对人脐带间充质干细胞来源的外泌体进行转录组学分析发现，有8种miRNA与细胞纤维化密切相关，表达量最高的miR-27b可以通过抑制同源盒蛋白Hox-C6(HOXC6)基因的表达，减少TGF-β2对RPE细胞EMT的诱导。Gu等[20]研究发现，ARPE-19细胞含有3种表达受高糖刺激影响的miRNA，由外泌体转运的miR-202-5p通过调控TGF/Smad通路，抑制高糖诱导的EMT。在DME的研究中，Jiang等[21]提出，患者血清外泌体miRNA表达具有特异性，而且，外泌体携带的miR-377-3p可以直接下调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，抑制RPE增殖，有效延缓疾病进展，且该基因的受试者工作特征曲线(ROC)分析显示，其能够对DME进行更加精确的诊断，该研究提示，miR-377-3p为该疾病提供了一个潜在的诊断标志物。由此可见，外泌体miRNA对疾病进展具有两面性，其携带的特定miRNA不仅可以加重视网膜损伤，还可以通过抑制VEGF表达来延缓疾病进展。此外，RPE细胞外泌体miRNA还是视神经衰老过程中小胶质细胞激活的关键调节因子。Morris等[22]对RPE细胞外泌体进行了miRNA组学分析，共检测到66个表达具有年龄依赖性的miRNA，其中高表达的miR-21可以上调小胶质细胞中p53信号通路下游基因的表达，从而调控衰老视网膜的慢性炎症反应，这表明，外泌体miRNA具有免疫调节作用。

以上研究表明，外泌体miRNA可通过调控EMT、VEGF表达、炎症反应等多种途径参与RPE损伤相关疾病的进程，具有成为病程预测标志物的潜力，甚至可能用于基因治疗。

1.2 外泌体转录组学与视网膜新生血管形成视网膜新生血管形成是DR、AMD等疾病的病理特征。Liu等[23]应用微阵列分析增生型DR(PDR)患者及黄斑裂孔患者的玻璃体源性外泌体，鉴定出82个在PDR样本中特异性高表达的miRNA；
对表达上调排名前5的miRNA进行验证显示，miR-9-3p通过靶向鞘氨醇-1-磷酸受体1(S1P1)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)/VEGF受体2通路调控视网膜新生血管形成，有潜力成为PDR的治疗靶点。与玻璃体源性外泌体相比，循环外泌体易于获取，为外泌体miRNA的研究提供了新思路。在新生血管性AMD的研究中，Grassmann等[24]对患者血浆外泌体miRNA的分析结果显示，hsa-miR-301a-3p，hsa-miR-361-5p和hsa-miR-424-5p可能通过TGF-β、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等信号通路参与疾病的发生和发展；
后续实验表明，hsa-mir-361-5p表达下调可以促进新生血管形成，这为理解疾病机制和设计靶向治疗方案提供了新的思路。随后，Elbay等[25]在AMD患者血清外泌体中发现，miR-486-5p、miR-626和miR-885-5p也具有特异性，主要与细胞凋亡和血管生成有关，该研究补充了对AMD发病机制的认识，提示这些miRNA可以作为疾病诊断的分子标志物。

此外，外泌体还可以通过转运特定circRNA促进血管生成。Zhang等[26]在DR患者视网膜样本中鉴定出529种异常表达circRNA，其中Circ_0005015在患者的玻璃体、血浆、视网膜前纤维血管膜中均高表达，且可通过外泌体转运来调节内皮细胞的增殖、迁移和血管形成，因此该circRNA具有作为DR诊断、治疗及预后标志物的潜力。

除了视网膜新生血管形成，外泌体circRNA介导的内皮细胞-周细胞串扰异常也是DR发病机制之一[27]。Liu等[28]检测并对比了具有瘦素受体缺陷的db/db小鼠与对照组小鼠视网膜circRNA的组成，鉴定出844个差异表达的circRNA；
对随机选择的20种circRNA进行聚类分析及验证显示，这些非编码RNA具有糖尿病样本特异性，其中cPWWP2A通过外泌体转运可以引起周细胞-内皮细胞串扰异常，导致视网膜血管功能障碍，是DR的潜在调节因子。Ye等[29]研究发现，低氧环境可以显著影响周细胞外泌体circRNA的表达，其中circEhmt1表达上调最显著，且该基因可使核因子I/A(NFIA)表达量增多，抑制NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体形成，导致周细胞-内皮细胞串扰异常。这些研究从细胞层面阐明DR的发病机制，为疾病干预提供了新视角。

不同细胞来源的外泌体所含有的miRNA分子具有异质性，因此一部分外泌体特定miRNA可以促进新生血管形成，另一部分则对视网膜微血管生成具有抑制作用[3]。Gu等[30]研究发现，间充质干细胞来源外泌体携带的miR-192可以负向调控整合素亚基α1(ITGA1)，抑制高糖环境中的视网膜新生血管形成，延缓DR进展。外泌体特异性miRNA的抗血管生成作用为DR的靶向治疗提供了新思路，但目前对抑制视网膜血管生成的外泌体RNA认识尚不全面，有待利用转录组学进一步探究。

作为疾病调控的新机制，外泌体功能性RNA的发现为DR、AMD等视网膜新生血管疾病的发生发展过程提出了新的见解，为疾病的早期诊断和治疗提供了指导。

1.3 外泌体转录组学与视网膜神经节细胞视网膜缺血-再灌注损伤(RIR)是青光眼的重要病理生理基础，最终导致视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡。RGCs损伤后不可再生，但越来越多的研究表明，外泌体可以通过调节炎症反应发挥神经保护作用[31-32]。Yu等[33]在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激的牙龈间充质干细胞外泌体中鉴定了28种炎症相关miRNA，其中miR-21-5p可以通过母源性印记基因3(MEG3)/miR-21-5p/程序性死亡因子4(PDCD4)信号轴减轻RIR引起的炎症反应，抑制RGCs凋亡，为青光眼提供了无细胞治疗策略。还有研究证实，外泌体中特定miRNA可以减少RGCs轴突缺失，使细胞功能障碍得到缓解，但外泌体在视神经保护过程中的转录组学特征尚不明确[34-35]。

1.4 外泌体转录组学与光感受器细胞光感受器细胞凋亡是视网膜退行性病变的重要病理特征，抑制该细胞凋亡是治疗的关键[36]。Bian等[37]通过分析外泌体miRNA表达谱发现，miR-181、miR-26、miR-9和let-7家族丰度较高，其中有17个miRNA通过下调炎症因子TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)和环氧合酶-2(COX-2)，抑制炎症信号通路，进而减少光感受器细胞凋亡。此外，Xu等[38]筛选出7个外泌体特异性miRNA；
后续验证结果显示，表达量最高的miR-24-3P可通过调节肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)-X-盒结合蛋白1(XBP1)信号通路，抑制缺氧诱导的光感受器细胞凋亡，这为早产儿视网膜病变的治疗研究提供了新思路。上述结果均揭示了外泌体miRNA对光感受器细胞的保护性作用，但具体机制仍需后续研究验证。

将转录组学分析应用于视网膜损伤的相关研究，深入了解外泌体在各种视网膜损伤疾病中的转录组学特征，不仅能筛选出DR、AMD、青光眼、早产儿视网膜病变等视网膜疾病诊断的新指标，还能找到潜在治疗靶点。值得注意的是，通过转录组学分析筛选出的生物标志物还需通过实验进一步验证。目前，外泌体转录组学分析在视网膜相关疾病研究中的应用处于起步阶段，主要用于差异表达基因的筛选。由于外泌体RNA与多种视网膜损伤相关疾病有着密切的关系，今后可以从鉴定靶基因功能、分析下游通路、构建基因互作网络等方面进行研究，从分子层面揭示视网膜损伤的病理机制，为疾病治疗找到新的靶点。

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