甲状腺乳头状癌术前FNAC和术后石蜡组织BRAF,V600E检测应用比较

王丛阳，郭文文，朱晓静，王 焱

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，并呈逐年上升趋势，其中甲状腺乳头状癌占80%～90%，BRAF V600E突变是其最常见的基因变异，突变率占35%～83%[1]。目前，临床检测BRAF V600E突变主要采用免疫组化和qRT-PCR法。本文采用免疫组化和qRT-PCR法检测甲状腺乳头状癌组织中BRAF V600E的突变，探讨两种技术在检测甲状腺乳头状癌中的差异及其应用价值。

1.1 临床资料收集2019年7月～2021年3月我院病理科存档的甲状腺手术标本1 269例，术后病理确诊甲状腺乳头状癌690例，男性134例，女性556例，男女比为1 ∶4.15，患者年龄24～77岁，中位年龄49岁。术后病理诊断甲状腺乳头状癌的石蜡组织同时行免疫组化和qRT-PCR检测BRAF V600E 143例；
术前细针穿刺细胞学(fine-needle aspiration cytology, FNAC)和术后石蜡肿瘤组织同时行qRT-PCR检测BRAF V600E 265例。本实验经我院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 甲状腺手术切除标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规HE染色。将甲状腺乳头状癌肿瘤细胞占比>50%石蜡标本，行免疫组化EnVision两步法检测。应用Ventana全自动免疫组化仪上机(Ventana公司，克隆号VE1)检测BRAF V600E突变状态。结果判读：由两名高年资病理医师对免疫组化结果进行判断，肿瘤细胞胞质呈棕黄色，判定为BRAF V600E阳性；
肿瘤细胞胞质未着色，判定为BRAF V600E阴性。

1.2.2qRT-PCR 本实验行免疫组化检测的石蜡组织同时进行qRT-PCR检测，切片5～8 μm厚(6～8张)，每个石蜡组织被切取前，切片机、镊子、一次性刀片均用乙醇擦拭消毒，防止交叉污染。切片置离心管中，二甲苯脱蜡2次，无水乙醇处理1次，室温挥发乙醇后，于56 ℃水浴裂解细胞2 h，按试剂盒说明书提取基因组DNA(厦门艾德公司)，提取DNA均行纯度和浓度检测。对样本进行上样处理，上样量为10 ng，每组样本均设阴、阳性对照，于qRT-PCR系统上机检测，上机流程严格依据操作指南进行，扩增程序依据BRAF V600E突变检测试剂盒说明书设定(厦门艾德公司)。结果判读：由两名专业人员进行判读，每次测试所有样品内控HEX均有扩增，呈S型阳性曲线；
同时阴性对照FAM信号无扩增，而阳性对照有扩增呈S型阳性曲线，则认为测试结果有效、继续分析。若测试样品FAM信号扩增呈S型曲线且Ct值<30，则判定为BRAF V600E突变阳性；
若样品FAM信号无S型曲线或Ct值≥30，则判定为阴性。

1.2.3测序验证 将石蜡组织提取的基因组DNA送基因公司测序。引物序列：上游：5′-CTTCATAAT GCTTGCTCTG-3′，下游：5′-GTAACTCAGCAGCATCT CAG-3′。测序结果同时进行软件和人工对比分析，以测序结果为金标准，评估免疫组化和qRT-PCR检测技术的应用价值。

1.2.4qRT-PCR检测术前FNAC和术后石蜡组织BRAF V600E突变 患者术前在甲状腺外科门诊手术室行FNAC，穿刺由资深甲状腺外科医师在超声引导下进行。穿刺组织注入BD公司保存液中，离心去上清，混匀后取部分组织裂解，提取基因组DNA，与术后石蜡组织分别行qRT-PCR检测BRAF V600E突变。

2.1 甲状腺乳头状癌中BRAF V600E的表达甲状腺乳头状癌组织经HE染色，镜下见肿瘤细胞呈乳头状分布，排列拥挤，细胞内核沟明显，部分细胞可见包涵体(图1)。690例甲状腺乳头状癌标本中有258例术后石蜡组织行免疫组化检测BRAF V600E的表达，其中阳性211例(81.78%)(图2)，阴性47例(18.22%)(图3)。

①②③

2.2 甲状腺乳头状癌中BRAF V600E的突变690例甲状腺乳头状癌术后石蜡组织中265例行qRT-PCR检测BRAF V600E突变，其中突变204例(76.98%)，未突变61例(23.02%)(图4)。

图4 qRT-PCR检测BRAF V600E突变扩增

2.3 甲状腺乳头状癌石蜡组织中BRAF V600E的免疫表型和分子突变在690例甲状腺乳头状癌组织中，143例术后石蜡组织同时行免疫组化和qRT-PCR检测BRAF V600E突变，免疫组化检测BRAF V600E阳性率为67.13%(96/143)，qRT-PCR检测BRAF V600E突变阳性率为62.24%(89/143)，经配对χ2检验，对比分析两种检测方法，差异有统计学意义(χ2=107.63，P<0.000 01，表1)。

表1 甲状腺乳头状癌石蜡标本同时行免疫组化和qRT-PCR检测BRAF V600E的突变

2.4 免疫组化和qRT-PCR检测BRAF V600E的对比分析143例甲状腺乳头状癌标本进行测序验证，检测BRAF V600E突变。测序结果显示BRAF V600E突变88例，与免疫组化和qRT-PCR结果一致；
测序BRAF V600E未突变55例(图5)，其中未突变的9例标本中，免疫组化检测BRAF V600E阳性8例，qRT-PCR检测BRAF V600E突变1例(表2)。以测序为金标准，免疫组化检测甲状腺乳头状癌BRAF V600E的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、假阴性率、假阳性率、准确率分别为100%、85.45%、91.67%、100%、0、14.55%、94.41%；
qRT-PCR检测BRAF V600E突变的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、假阴性率、假阳性率、准确率分别为100%、98.19%、98.88%、100%、0、1.8%、99.30%(表3)。免疫组化和qRT-PCR检测甲状腺乳头状癌BRAF V600E的灵敏度和阴性预测值均为100%，假阴性率均为0，但qRT-PCR检测BRAF V600E特异度、阳性预测值、准确率明显优于免疫组化，对比分析，免疫组化检测有较高的假阳性率。

表2 免疫组化和qRT-PCR检测BRAF V600E的对比分析

表3 免疫组化和qRT-PCR检测BRAF V600E的应用价值对比分析(以测序为金标准)

图5 BRAF V600E测序：A.BRAF V600E未突变；
B.BRAF V600E突变

2.5 术前FNAC和术后石蜡组织BRAF V600E突变对比分析265例甲状腺乳头状癌患者术前FNAC和术后石蜡组织分别行qRT-PCR检测BRAF V600E突变，术前FNAC检测BRAF V600E突变阳性率为69.81%(185/265)，术后石蜡肿瘤组织检测BRAF V600E突变阳性率为76.98%(204/265)，与术后石蜡组织比较，术前FNAC检测BRAF V600E有较高假阴性，假阴性率为10.29%(21/204)。经配对χ2检验，结果显示术后病理石蜡组织BRAF V600E突变阳性检出率明显高于术前FNAC标本，差异有统计学意义(χ2=166.43，P<0.000 01，表4)。

表4 甲状腺乳头状癌术前FNAC和术后石蜡组织qRT-PCR检测BRAF V600E的突变

甲状腺肿瘤标本BRAF V600E突变检测，对甲状腺肿瘤的诊断、治疗、手术方式选择及预后评估有重要意义[2]。BRAF V600E突变在甲状腺乳头状癌组织中具有高度特异性，而在正常甲状腺组织、乳头状增生及滤泡性肿瘤中常无突变[3]。BRAF V600E突变的甲状腺乳头状癌患者可能发生局部浸润和中央区淋巴结转移，手术通常需要进行中央区淋巴结清扫[4]。对于无法手术或转移的BRAF V600E突变的甲状腺未分化癌患者，联合使用靶向药物曲美替尼和达拉非尼可以得到有效缓解[5]。因为BRAF V600E突变导致摄碘基因的表达缺失，从而影响摄碘基因的转运，所以对于BRAF V600E突变的患者，不建议进行I131治疗[6]。BRAF V600E突变是预后不佳的分子指标[7-8]，有30%的甲状腺乳头状癌BRAF V600E突变患者存在复发风险。

本实验中甲状腺乳头状癌BRAF V600E免疫组化阳性检出率为81.78%，qRT-PCR阳性检出率为76.98%，与文献报道相符(35%～83%)[9]。通常基因发生突变在蛋白水平免疫组化检测中会有表达，然而在有些病例中基因虽然发生突变，但免疫组化并未检测到突变蛋白，这可能与基因的改变并未影响蛋白的转录翻译有关，导致免疫组化结果假阴性。但本实验通过测序作为金标准，发现免疫组化和qRT-PCR检测BRAF V600E灵敏度均为100%、假阴性率均为0，两者相比差异无显著性。因此，免疫组化作为常规的检测手段，其操作简便、成本较低，可以作为甲状腺乳头状癌BRAF V600E突变的初筛。

本实验结果亦显示，免疫组化检测的假阳性率(14.55%)明显高于qRT-PCR(1.8%)，有较多的病例经测序证实免疫组化检测呈假阳性。这可能与抗体的特异性、阅片者的主观经验及肿瘤组织的异质性、非BRAF V600E蛋白的表达以及操作过程等因素相关。另外，本实验显示qRT-PCR技术用于甲状腺乳头状癌BRAF V600E检测，其特异度(98.19%)、阳性预测值(98.88%)、准确率(99.30%)均优于免疫组化，尤其假阳性率明显低于免疫组化，这可能与该检测设计单管封闭操作、严格设置阴阳性对照以及试剂盒自身携带的内对照、排除人为的主观因素等有关。国内外指南均推荐对甲状腺乳头状癌标本进行基因水平BRAF V600E突变检测。因此，在甲状腺乳头状癌BRAF V600E检测中，qRT-PCR技术优于免疫组化，值得推广使用。

另外，本实验应用qRT-PCR技术对甲状腺乳头状癌术前FNAC和术后石蜡肿瘤组织标本分别进行BRAF V600E检测，结果显示：术前FNAC甲状腺乳头状癌BRAF V600E突变阳性检出率为69.81%(185/265)，术后石蜡肿瘤组织BRAF V600E突变阳性检出率为76.98%(204/265)。术后石蜡组织qRT-PCR检测BRAF V600E准确率达99.30%，该实验术前和术后两种类型标本同时应用qRT-PCR检测，说明与术后石蜡肿瘤组织相比，术前FNAC标本检测BRAF V600E存在较高假阴性率，达10.29%(21/204)，有较多的BRAF V600E突变病例未能检出。术前FNAC标本假阴性的原因可能与以下因素有关：FNAC效果与穿刺者的经验、手法、熟练度及穿刺肿物的大小、位置等相关；
另也与FNAC组织获取较少，且血液等非肿瘤组织引起杂质等因素有关，导致穿刺标本不含肿瘤组织或肿瘤组织含量较低[10-11]，低于qRT-PCR技术的检测下限，造成结果假阴性。术前FNAC标本BRAF V600E检测，对甲状腺肿物良恶性的判断、辅助诊断及手术范围的选择有重要意义。因此，术前FNAC标本BRAF V600E检测仍然不失为理想的检测手段。鉴于FNAC自身的局限性，导致其假阴性率较高，建议术后病理组织诊断为甲状腺乳头状癌，而术前FNAC检测BRAF V600E阴性的标本，应再次进行石蜡组织BRAF V600E复检，以排除FNAC检测假阴性，更有利于后续治疗及预后评估。

综上所述，在甲状腺乳头状癌BRAF V600E检测中，qRT-PCR技术优于免疫组化。术后石蜡组织BRAF V600E突变检出率明显高于术前FNAC标本，甲状腺乳头状癌术前FNAC检测BRAF V600E阴性的病例，建议术后石蜡组织复检BRAF V600E突变状态。

猜你喜欢石蜡乳头状免疫组化体积占比不同的组合式石蜡相变传热数值模拟煤气与热力(2022年2期)2022-03-09夏枯草水提液对实验性自身免疫性甲状腺炎的治疗作用及机制研究浙江医学(2020年9期)2020-07-01婴幼儿原始黏液样间叶性肿瘤一例及文献复习浙江中西医结合杂志(2019年4期)2019-05-05结直肠癌组织中SOX9与RUNX1表达及其临床意义浙江医学(2019年2期)2019-01-23二元低共熔相变石蜡的制备及热性能研究新型建筑材料(2018年11期)2018-11-23世界石蜡市场供需现状及预测现代工业经济和信息化(2018年10期)2018-02-21空间大载荷石蜡驱动器研制北京航空航天大学学报(2017年5期)2017-11-23甲状腺乳头状癌中Survivin、VEGF、EGFR的表达及临床意义分析癌症进展(2016年10期)2016-03-20子宫瘢痕妊娠的病理免疫组化特点分析中国继续医学教育(2015年1期)2016-01-06SUMO4在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义中国病理生理杂志(2015年8期)2015-12-21