HPLC法测定自发性腹膜炎患者腹腔积液中安妥沙星的方法学及其药动学研究

胡浩然，孙学强，邢亚群，韩卓越，林 翔(蚌埠医学院第二附属医院药剂科，蚌埠 040；
蚌埠医学院药学院；
蚌埠医学院第二附属医院感染科；
通讯作者，E-mail:6747749@qq.com)

严重的细菌感染(bacterial infection)，如自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis，SBP)、肺炎或败血症，是晚期肝硬化患者常见的威胁生命的并发症。肝硬化患者，尤其是处于晚期疾病阶段，免疫监视功能受损，对病原体的反应降低，同时出现“疲惫”的全身炎症[1]，使其感染难以控制。并且对细菌感染的高度易感性和过度的全身反应都会引发肝和肝外器官功能障碍，易导致急性和慢性肝功能衰竭[2]以及门静脉高压突然恶化。针对BI制定积极的、个体化用药的策略已成为肝病学多个领域的基石。相关研究已经证明，在肝硬化失代偿期患者中，每不恰当使用抗生素1 h，死亡几率就会增加1.9倍[3]。因此，及时、充分的抗生素管理对伴有细菌感染的肝硬化失代偿自发性腹膜炎患者的病情控制极为重要。而近年来，由于抗菌药物的滥用，抗生素耐药性已成为本世纪公共卫生的主要威胁，交叉耐药、多重耐药等问题的出现为临床疾病尤其是自发性腹膜炎的预防和治疗带来愈加严峻的挑战，临床上自发性腹膜炎诊疗急需寻找新的抗菌药物进行替代治疗。安妥沙星是我国有完全自主知识产权的1.1类喹诺酮类新药，2009年批准上市，具有良好的体内外抗菌能力和安全性，相关报道已证明了安妥沙星用于肝硬化自发性腹膜炎患者的安全性[4，5]，且其药理学和微生物学特征使其成为晚期肝硬化患者抗感染的优先选择。国内外针对安妥沙星在健康人群中的血药浓度测定已有相关文献报道[6-10]，但血浆中的内源性物质和腹腔积液中有所不同，血药浓度不能直接反应感染部位的药物分布情况，目前在该类领域尚缺乏足够的药代动力学数据研究。本文旨在通过高效液相色谱-紫外检测器，建立肝硬化自发性腹膜炎人群感染部位的药物浓度测定方法及药动学研究，为指导临床医师更合理、更安全地应用安妥沙星提供十分重大的临床意义。

1.1 实验仪器

LC-20A高效液相色谱仪(岛津企业管理(中国)有限公司)；
ME204E电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；
Multifuge X1R低温高速离心机(赛默飞世尔科技有限公司)；
A10TOC纯水仪(北京科誉兴业科技发展有限公司)；
XP205电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；
MCR-88-8台式低温高速离心机(ESCO生命科学集团)；
-80 ℃低温冰箱(中国海尔公司)；
涡旋混合器(ABSON科学仪器有限公司)。

1.2 试剂与药品

安妥沙星对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130457-201101，含量：90.9%)；
氧氟沙星对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130454-202007，含量：99.7%)；
甲醇和乙腈(色谱纯，默克公司)；
超纯水(实验室提供)，其他试剂为分析纯。

1.3 研究对象

选择蚌埠医学院第二附属医院感染科收治的6名肝硬化自发性腹膜炎患者，采集6名患者的腹腔积液。本研究经过蚌埠医学院第二附属医院临床试验伦理委员会批准(伦理号为：2021-10)，所有受试者均签署知情同意书。

研究入选标准：①临床、影像学和肝功能等实验室检查符合肝炎后肝硬化诊断(肝脏穿刺)，排除肝癌；
②B超或CT提示有腹腔积液者，且临床上有明显腹胀腹痛，食欲下降，恶心呕吐及相关腹水体征；
③SBP诊断依据为入院时腹水检查中性粒细胞(PMN)计数>250/mm3；
④临床实验室和影像学资料不支持继发性腹膜炎；
⑤血浆肌酐(Cr)浓度<84 μmol/L；
⑥既往无肝性脑病病史，入院时无Ⅱ～Ⅳ级肝性脑病；
⑦无上消化道出血；
⑧腹平片及CT提示无肠梗阻；
⑨电解质无紊乱；
⑩患者心电图无明显异常。

排除标准：①过敏体质，既往有氟喹诺酮类药物过敏史或已知对安妥沙星或制剂辅料中任何其他成分过敏者；
②有潜在的心律失常或者QT间期延长史。

2.1 给药方法和样本采集

符合入选标准且不符合排除标准的入院病人行腹腔穿刺引流术后，单次口服盐酸安妥沙星片400 mg；
按照用药方法嘱其服药后，给药前记为0 h，并在给药后0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，12，24，36，48，72 h收集病人腹腔积液样本，4 ℃ 4 000 r/min离心10 min取上清保存于-80 ℃冰箱待测。

2.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18(4. 6 mm×150 mm，5 μm)；
流动相：A相为0.05 mol/L KH2PO4缓冲液(缓冲液中含0.005 mol/L乙烷磺酸钠，0.007%乙二胺四乙酸二钠，磷酸调pH=2.4)，B相为乙腈，A相 ∶B相=85 ∶15；
检测波长：297 nm，流速：1.0 ml/min；
进样量：20 μl；
柱温：30 ℃。

2.3 溶液的配制

2.3.1 安妥沙星对照品溶液配制 精密称定安妥沙星对照品11.5 mg(安妥沙星记为10 mg)，置于50 ml容量瓶中，加入溶剂(甲醇与水体积比1 ∶1)溶解定容至刻度，摇匀，得200 μg/ml安妥沙星储备液，将所得对照品储备液置于4 ℃条件下贮存，使用前将安妥沙星母液用甲醇与水体积比1 ∶1逐级稀释成20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.125 μg/ml系列对照品溶液。

2.3.2 氧氟沙星对照品(内标用)溶液配制 精密称定氧氟沙星对照品20 mg，置于50 ml容量瓶中，加入溶剂甲醇与水体积比1 ∶1溶解定容至刻度，摇匀，得400 μg/ml氧氟沙星储备液，将所得对照品储备液置于4 ℃条件下贮存，使用前将氧氟沙星母液用甲醇与水体积比1 ∶1稀释成20 μg/ml对照品溶液。

2.4 腹腔积液样品处理

取-80 ℃冰箱冻存的腹腔积液样本于4 ℃条件下解冻，取样品200 μl置于1.5 ml离心管中，加入20 μl(20 μg/ml)内标液混匀，再加入600 μl纯甲醇，置于旋转混合器震荡1 min后，在14 000 r/min下离心10 min，离心后的混合样品取上清液，经0.22 μm的微孔滤膜过滤，置于自动进样分析瓶中进样测定。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性考察 分别取空白腹腔积液、安妥沙星对照品溶液+空白腹腔积液、内标物质氧氟沙星溶液+空白腹腔积液、待测腹腔积液样本(给药后6 h)，按“2.4”项下方法处理，于“2.2”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。在“2.2”描述的色谱条件下，腹腔积液中的内源性物质、内标物氧氟沙星与安妥沙星分离度较好(分离度R>1.5)，安妥沙星在18.5 min左右出峰，且空白腹腔积液、内标物氧氟沙星对安妥沙星的出峰均无干扰，基线平稳(见图1)。表明在上述色谱条件下专属性良好。

图1 安妥沙星和氧氟沙星在自发性腹膜炎患者腹水中的高效液相色谱图Figure 1 The HPLC chromatograms of antofloxacin and ofloxacin in ascites of patients with spontaneuous peritonitis

2.5.2 标准曲线制备和线性关系考察 取事先配置好的安妥沙星母液，用甲醇与水体积比1 ∶1逐级稀释分别配制成质量浓度为20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.312 5，0.125 μg/ml的腹腔积液溶液，按“2.4”项下方法处理，“2.2”项色谱条件进样分析，每个浓度样品分别测定3次，以安妥沙星浓度X为横坐标，安妥沙星和内标物氧氟沙星的峰面积之比Y为纵坐标，权重因子为1/X2，对两者进行线性回归计算。线性方程为Y=0.131 1X-0.003 1，R2=0.999 6，实验表明样品在0.125～20 μg/ml范围内线性关系良好。

2.5.3 定量下限确定 精密量取含安妥沙星对照品的空白腹腔积液，逐级稀释，按“2.4”项下方法处理，“2.2”项色谱条件下进样，在经过逐级稀释进样测定后，得出安妥沙星对照品在0.125 μg/ml时其信噪比(S/N=10)，由此确定本方法定量下限为0.125 μg/ml。

2.5.4 准确度和精密度 分别制备安妥沙星质控样品QC低、中、高3个浓度(0.625，2.500，15.000 μg/ml)的腹腔积液样本各6份，按“2.4”项下方法处理，“2.2”项色谱条件进样分析，按“2.5.2”项下操作，用当日随行标准曲线测定QC样品浓度，计算日内精密度和准确度；
每天同法测定，连续进样分析质控样品3 d，测定3 d的日间精密度和准确度。结果显示，低、中、高浓度日内、日间精密度和准确度均符合相关要求(见表1)。

表1 腹水中安妥沙星的精密度和准确度 (n=6)Table 1 Precision and accuracy of antofloxacin in ascites (n=6)

2.5.5 加样回收率考察 分别制备安妥沙星质控样品QC低、中、高3个浓度(0.625，2.500，15.000 μg/ml)的腹腔积液样本各6份，按“2.4”项下方法处理，“2.2”项色谱条件进样分析，得质控样品的峰面积记为A1，另将与质控样品浓度一致的空白提取液加工作液样本进样分析的峰面积记为A2，安妥沙星腹水中加样回收率为A1/A2。结果显示，低、中、高3种浓度的质控样品的回收率均落在80%～120%的区间且RSD值在±15%内(见表2)，符合药典标准。

表2 腹水中安妥沙星的加样回收率 (n=6)Table 2 Recovery of antoloxacin in ascites (n=6)

2.5.6 稳定性实验 分别制备安妥沙星质控样品QC低、中、高3个浓度(0.625，2.500，15.000 μg/ml)的腹腔积液样本各6份，按“2.4”项下方法处理，“2.2”项色谱条件进样分析，考察安妥沙星腹水样本在室温放置4 h、-20 ℃反复冻融3次、-20 ℃冰冻30 d条件下的样品稳定性。结果显示，在室温下放置4 h、反复冻融3次、-20 ℃冻存30 d这3种情况下样品稳定性良好(见表3)。

表3 腹水中安妥沙星的稳定性 (n=6)Table 3 Stability of antofloxacin in ascites (n=6)

2.6 药代动力学研究

6名肝硬化自发性腹膜炎患者单次口服400 mg盐酸安妥沙星片后，分别采集“2.1”项下各个病人各个时间的腹腔积液样品，“2.4”项下方法处理，“2.2”项色谱条件进样分析；
带入标准曲线中计算腹腔积液样品中的安妥沙星浓度，6名肝硬化自发性腹膜炎患者单次口服400 mg盐酸安妥沙星片后腹腔积液中安妥沙星浓度-时间曲线见图2；
winnonlin 8.1软件对腹水浓度数据进行处理，得到相关药代动力学参数(见表4)。

图2 自发性腹膜炎患者单次给药400 mg盐酸安妥沙星腹水药物浓度-时间曲线 (n=6)Figure 2 Dose-time curve of drug in ascites in patients with spontaneous peritonitis after given 400 mg antofloxacin hydrochloride tablet (n=6)

表4 自发性腹膜炎患者单次给药400 mg盐酸安妥沙星腹水中药代动力学参数 (n=6)Table 4 Pharmacokinetic parameters of drug in ascites in patients with spontaneous peritonitis after 400 mg antofloxacin hydrochloride tablet (n=6)

3.1 处理方法的确定

在实验前期，本研究借鉴了相关氟喹诺酮类药物研究胸腔积液的处理方法[11，12]，从而对腹腔积液的处理方法采用了氮气仪浓缩复溶的方法来处理，发现采用该方法处理得到的腹腔积液中安妥沙星的回收率极低，难以满足实验要求，后查阅相关文献[6，8，9]，决定更换为有机溶剂直接沉淀蛋白的方法来处理腹腔积液，同时针对市面上常见的蛋白沉淀有机溶剂甲醇和乙腈分别进行了研究，发现使用3倍体积的甲醇在毒性、出峰干扰上优于乙腈，同时结果表明在使用甲醇沉淀蛋白处理下，腹腔积液中安妥沙星的提取回收率达95%以上，符合实验要求。

3.2 色谱条件的确定

3.2.1 流动相比例的优化 本研究在实验过程中分别尝试不同的流动相比例，来寻找最合适实验的条件，实验结果显示流动相配比85 ∶15时，对安妥沙星与内标物氧氟沙星的分离度较好，满足实验要求(R>1.5)，且空白基质中的内源性成分对二者出峰影响较小。

3.2.2 柱温的优化 理论上提高色谱柱柱温可以降低流动相的黏度、增加样品在流动相中的溶解度、缩短样品的保留时间，因此控制柱温可调整待测物质出峰时间[12]。本研究比较了柱温为30 ℃，35 ℃，40 ℃时安妥沙星、内标氧氟沙星的吸收峰的峰形、两者的分离度、拖尾因子等，考虑到柱温过高可能缩短色谱柱寿命、影响生物样品的稳定性，因此最终柱温确定为30 ℃。

3.3 临床应用性

安妥沙星为我国自主研发的新型氟喹诺酮类药物，是临床上常见的抗菌药，临床上主要用于大肠埃希菌引起的急性肾盂肾炎和膀胱炎，而肝硬化自发性腹膜炎患者的相关菌种研究报道发现该类患者的细菌培养也以大肠埃希菌为主，大约占1/3左右[13-15]。目前已有相关研究证实了安妥沙星用于肝硬化自发性腹膜炎患者的安全性[4，5]，但除了安全性和疗效评价，尚无充分的药动学研究证据支撑自发性腹膜炎患者使用安妥沙星。本研究建立了一套测定患者腹腔积液中安妥沙星浓度的HPLC法，同时收集分析了患者单次给药400 mg后腹腔积液的药动学数据，与研究报道的健康人群单次给药400 mg血药浓度Cmax，T1/2和Tmax相差较大[8]，分析原因可能是由于肝硬化自发性腹膜炎患者肝功能低下药物清除速率较慢、腹膜厚度、腹膜内源性物质及腹膜穿透率的差异导致这种现象。本实验中建立的方法灵敏、可靠、准确度高，样品处理简单方便，出峰速度快，20 min即可完成1个样品分析，分析成本较低，适用于临床安妥沙星腹腔积液浓度测定及自发性腹膜炎患者腹部药动学研究。

3.4 不足

由于本研究的开展方案为单中心，且入选患者样本量不大，因此最终得出的实验数据可能会有所偏倚，不一定适用于所有该类临床疾病患者。本课题组预计下一步在此实验研究基础上扩大患者样本量，开展安妥沙星在自发性腹膜炎患者首剂服药400 mg，后每天给药200 mg用药方案的药动学研究，以期为临床相关诊疗提供完整、安全的安妥沙星用药指导和个体化服务。

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