黄芪甲苷通过NF-κB／NLRP3,信号通路减轻肺动脉高压大鼠的炎症反应

孙 洋，王洪新

（锦州医科大学心脑血管药物研究重点实验室，辽宁 锦州 121001）

肺动脉高压的特征是血管过度收缩和闭塞性血管重塑，其组织病理学特征包括肺血管的内膜和外膜层增厚，以及血管闭塞和丛状病变［1-2］，研究表明，在其肺血管系统和右心室中，炎症因子水平有所增加［3］，提示炎症在肺动脉高压中发挥着重要作用。NLRP3 炎性小体是一种多蛋白促炎复合物，由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和位于细胞质中的caspase-1 组成［4］。在肺动脉高压大鼠的肺组织中，NF-κB 的表达增加，此外，终末期特发性肺动脉高压患者的肺血管中NF-κB 也被激活，这说明NF-κB 的激活可能促进了该疾病的发展［5］。

黄芪是我国传统珍贵药材，具有抗菌、止汗、消炎、利尿和滋补的作用，皂苷、类黄酮和多糖等成分被认为是黄芪的主要活性成分［6］。黄芪甲苷是从黄芪中提取的四环三萜皂苷，对多种心血关疾病具有保护作用［7］，已有研究表明，黄芪甲苷对肺动脉高压具有保护作用［8］，但具体改善机制尚不清楚。因此，本实验在体内和体外水平上，分别探讨黄芪甲苷对肺动脉高压的保护作用和潜在机制。

1.1 试剂与药物 黄芪甲苷（纯度≥98.0%，南京景竹生物科技有限公司）。野百合碱、炎症小体NLRP3 抑制剂MCC950、核转录因子NF-κB 抑制剂Bay11-7082（美国Sigma 公司，货号 315220、538120、B5556）；
GAPDH、NLRP3、NF-κB 抗体（美国Proteintech 公司，货号60004-1-Ig、19771-1-AP、14220-1-AP）；
FITC 荧光染料（北京鼎国生物技术有限责任公司，货号CSB-L05598m）；
Alexa Fluor 488 荧光二抗、BeyoClickTMEdU-488 细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号A0423、C0071S）。

1.2 仪器 半干转转膜仪、化学发光成像仪（美国Bio-Rad 公司）；
NM-9602G 型酶标分析仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；
DMI3000B 型显微镜（德国Leica 公司）；
制冰机（日本大阪松下电器产业株式会社）。

1.3 动物和细胞 健康雄性SD 大鼠60 只，体质量（200±10）g，由锦州医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（辽）2014-0004。人肺动脉内皮细胞（HPAECs），购自通派（上海）生物科技有限公司。

2.1 分组和给药 将60 只大鼠随机分为对照组、模型组、MCC950 组（10 mg／kg）、Bay11-7082 组（5 mg／kg）、黄芪甲苷组（40、80 mg／kg），通过单次腹腔注射野百合碱建立肺动脉高压模型，黄芪甲苷组大鼠连续灌胃40、80 mg／kg黄芪甲苷28 d，MCC950 组（10 mg／kg）和Bay11-7082 组（5 mg／kg）大鼠腹腔注射相应剂量药物。

HPAECs 细胞在含10%胎牛血清的ECM 培养基中，于37 ℃、5%CO2条件下培养。HPAECs 细胞用野百合碱吡咯诱导24 h，然后用MCC950（10 μmol／L）、Bay 11-7082（10 μg／mL）、黄芪甲苷（50、100 μmol／L）分别处理30 min。

2.2 右心室导管插管法检测血流动力学 使用BL-420S 生物信号采集和分析系统，通过右心室导管插管测定右心室收缩压和平均肺动脉压。分别测定左心室壁（LV）、室间隔（S）和右心室壁（RV），右心肥厚指数表示为右心室与左心室加上隔膜的重量比，公式为右心肥厚指数＝RV／（LV＋S）。

2.3 ELISA 法检测大鼠血清TNF-α 水平以及HPAECs 细胞IL-6、TNF-α 水平 按照ELISA 试剂盒说明书测定大鼠血清TNF-α 水平以及HPAECs 细胞IL-6、TNF-α 水平。

2.4 免疫组化法检测大鼠肺组织IL-6 蛋白表达 4%多聚甲醛固定肺组织，石蜡包埋，切片，经热修复、封闭后，IL-6 抗体4 ℃孵育过夜，滴加二抗，DAB 显色，苏木素染核，透明后中性树脂封片。在显微镜下观察到有棕黄色颗粒沉淀即为IL-6 表达，通过Image-Pro Plus 软件进行分析，蛋白表达为阳性表达面积／总细胞面积。

2.5 免疫荧光法检测大鼠肺组织NLRP3、NF-κB 蛋白表达 4%多聚甲醛固定肺组织，石蜡包埋，高压抗原修复，滴加NLRP3、NF-κB 一抗，4 ℃过夜后滴加荧光二抗，DAPI 染核，在荧光倒置显微镜下观察，通过Image-Pro Plus 软件进行分析，蛋白表达为荧光光密度总和／面积总和。

2.6 EdU-488 增殖试剂盒检测HPAECs 细胞增殖情况 按照试剂盒说明书进行操作，通过Image-Pro Plus 软件进行分析，细胞增殖率为EdU-488 光密度总和／面积总和。

2.7 Western blot 法检测HPAECs 细胞NLRP3、NF-κB 蛋白表达 提取细胞总蛋白后BCA 法测定浓度，将样品蛋白通过SDS-PAGE 凝胶进行分离，并转移至PVDF 膜上，封闭1.5 h，然后与NLRP3、NF-κB 抗体4 ℃孵育过夜，与二抗室温孵育2 h，ECL 法显色，曝光，用Image J 软件分析结果。

2.8 统计学分析 通过SPSS 25.0 软件进行处理，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3.1 黄芪甲苷对肺动脉高压大鼠血流动力学和体质量的影响 与对照组比较，模型组大鼠右心肥厚指数、右心室收缩压和平均肺动脉压均升高（P＜0.01），体质量降低（P＜0.01）；
与模型组比较，黄芪甲苷组、MCC950 组和Bay11-7082 组大鼠右心肥厚指数、右心室收缩压和平均肺动脉压均降低（P＜0.01），体质量升高（P＜0.01），说明黄芪甲苷对肺动脉高压大鼠的肺动脉高压有改善作用，见图1。

图1 黄芪甲苷对肺动脉高压大鼠血流动力学和体质量的影响（±s， n＝6，1 mmHg＝0.133 kPa）

3.2 黄芪甲苷对肺动脉高压大鼠血清TNF-α 水平和肺组织IL-6 表达的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清TNFα 水平和肺组织IL-6 表达均升高（P＜0.01）；
与模型组比较，黄芪甲苷组、MCC950 组和Bay11-7082 组大鼠血清TNF-α 水平和肺组织IL-6 表达均降低（P＜0.01），说明黄芪甲苷能够减轻肺动脉高压大鼠炎症反应，见图2。

图2 黄芪甲苷对肺动脉高压大鼠血清TNF-α 水平和肺组织IL-6 表达的影响（±s， n＝6）

3.3 黄芪甲苷对肺动脉高压大鼠NF-κB／NLRP3 信号通路的影响 与对照组比较，模型组大鼠肺组织NLRP3、NFκB 蛋白表达升高（P＜0.01）；
与模型组比较，黄芪甲苷组、MCC950 组和Bay11-7082 组大鼠肺组织NLRP3、NFκB 蛋白表达均降低（P＜0.01），说明黄芪甲苷对肺动脉高压大鼠的保护作用可能通过抑制NF-κB／NLRP3 信号通路，见图3。

图3 黄芪甲苷对肺动脉高压大鼠NF-κB／NLRP3 信号通路的影响（±s， n＝6，×400）

3.4 黄芪甲苷对HPAECs 细胞增殖的影响 与对照组比较，模型组HPAECs 细胞增殖率升高（P＜0.01）；
与模型组比较较，黄芪甲苷组、MCC950 组和Bay11-7082 组HPAECs 细胞增殖率降低（P＜0.01），说明黄芪甲苷能改善HPAECs 细胞增殖情况，见图4。

图4 黄芪甲苷对HPAECs 细胞增殖的影响（±s， n＝6，×400）

3.5 黄芪甲苷对HPAECs 细胞炎症因子TNF-α、IL-6 水平的影响 与对照组比较，模型组HPAECs 细胞TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.01）；
与模型组比较较，黄芪甲苷组、MCC950 组和Bay11-7082 组HPAECs 细胞TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.01），见图5。

图5 黄芪甲苷对HPAECs 细胞TNF-α、IL-6 水平的影响（±s， n＝6）

3.6 黄芪甲苷对HPAECs 细胞NF-κB／NLRP3 信号通路的影响 与对照组比较，模型组HPAECs 细胞NF-κB、NLRP3 蛋白表达升高（P＜0.01）；
与模型组比较，黄芪甲苷组、MCC950 组和Bay11-7082 组HPAECs 细胞NF-κB、NLRP3 蛋白表达降低（P＜0.01），见图6。

图6 黄芪甲苷对HPAECs 细胞NF-κB／NLRP3 信号通路的影响（±s， n＝6）

野百合碱可引起肺动脉高压，单次腹腔注射可建立肺动脉高压动物模型。在细胞色素P-450（CYP3A4）的作用下，野百合碱在肝脏代谢为吡咯烷（野百合碱吡咯），选择性地损伤肺动脉内皮细胞，最终引起肺动脉高压［9］。内皮细胞增殖和炎症参与了肺动脉高压疾病发展的进程［10］。临床前研究和人体试验表明，炎症在肺动脉高压中发挥着重要作用。细胞炎症因子水平的升高与肺动脉高压患者不良预后有关［11］，在肺动脉高压患者的血清中，TNF-α、IL-6 水平升高［12-13］；
在肺动脉高压大鼠的肺组织中，NF-κB表达增加，而NF-κB 的激活可能促进了该疾病的发展［14］。NF-κB 的活化能激活NLRP3 炎性小体，并能诱导NLRP3和pro-IL-1β 的转录［13］，研究证实，NLRP3 在肺动脉高压起着重要作用，参与了肺动脉高压的疾病发展［15］。由此推测黄芪甲苷可能通过NF-κB／NLRP3 信号通路来减轻肺动脉高压大鼠的炎症反应。

实验结果表明，黄芪甲苷组能够降低肺动脉高压大鼠右心室收缩压、平均肺动脉压和右心肥厚指数，改善肺动脉高压大鼠体质量降低情况，说明黄芪甲苷可以改善肺动脉高压大鼠血流动力学和生活质量。实验还发现，黄芪甲苷可以改善HPAECs 细胞的增殖情况，下调肺动脉高压大鼠血清、肺组织和HPAECs 细胞中IL-6、TNF-α 水平和NFκB、NLRP3 表达，说明黄芪甲苷可在体内和体外减轻野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠或HPAECs 细胞的炎症反应。进一步实验表明，与模型组比较，MCC950 组和Bay11-7082组IL-6、TNF-α 水平和NF-κB、NLRP3 蛋白表达降低，提示MCC950 和Bay11-7082 能够减轻肺动脉高压大鼠和HPAECs 细胞中的炎症反应，并且这种作用与黄芪甲苷类似。

综上所述，黄芪甲苷能够减轻肺动脉高压大鼠的炎症，其机制可能是通过NF-κB／NLRP3 信号通路发挥作用。

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