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HPLC,法同时测定五虎汤加味中6,种成分

来源:专题范文 时间:2024-01-26 13:57:02

于琳琳,王 婧,丁惠玲,郑景珂,景晓平*

(1.上海市儿童医院/上海交通大学医学院附属儿童医院,上海 200062;

2.杭州医学院药学院,浙江杭州 310053)

支气管哮喘是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病[1-2],全球儿童发病率不断上升,尤其是在发展中国家[3-4],严重威胁患儿身心健康[5-7],中医药治疗本病临床经验丰富,疗效显著。五虎汤加味是在五虎汤基础上结合甘草干姜汤加减成方,全方组成为麻黄、杏仁、石膏、桑白皮、细辛、黄芩、皂角刺、干姜、豆蔻、甘草,具有清肺化痰、止喘温中功效,其中前者在哮喘、肺炎喘嗽治疗过程中临床疗效显著[8-10],后者治疗肺脾阳虚较多,故全方临床应用前景广阔。

课题组前期研究表明,五虎汤加味能显著改善哮喘患儿肺功能指标,降低IgE、EOS 计数和部分炎症因子水平,临床疗效显著[11];
文献[12-13]报道,该方可减轻哮喘小鼠肺组织中气道炎症。因此,本实验建立HPLC 法同时测定五虎汤加味中黄芩主要成分黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素,干姜主要成分6-姜辣素,细辛主要成分细辛脂素,甘草主要成分甘草酸的含量,以期为该方质量控制提供依据。

1.1 仪器 Waters2695 型高效液相色谱仪,配置2996PDA 检测器、Empoer3 色谱工作站、自动进样器、四元梯度泵(美国Waters 公司);
Milli-Q 超纯水器(杭州景元科技有限公司);
PTF-A500 型电子分析天平(福州华志科学仪器有限公司);
MewClassic MS 精密天平(瑞士Mettler-Toledo 公司);
DKS-26 电热恒温水浴锅(杭州蓝天化验仪器厂);
EYELA 冷却水循环装置(上海爱朗仪器有限公司),SK-7210LHC 超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 五虎汤加味组方药材分别购于上海市儿童医院、孙泰和国医国药馆、杭州开心大药房,经杭州医学院李元圆副教授鉴定为正品,凭证标本保存于杭州医学院药学院天然药物化学实验室。黄芩苷(批号FY09B712)、黄芩素(批号FY12970510)、6-姜辣素(批号FY19B0601)、细辛脂素(批号FY19B0809)对照品均购于南通飞宇生物科技有限公司,纯度≥98%;
甘草酸(批号190720)、汉黄芩苷(批号191207)对照品均购于上海融禾医药科技有限公司,纯度≥98%。甲醇为色谱纯(批号28.02.11),购自默克化工技术(上海)有限公司;
其他试剂均为分析纯;
水为超纯水(由Milli-Q 型超纯水器制得)。

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量,甲醇制成黄芩苷、汉黄芩苷质量浓度分别为825.20、144.40 μg/mL 的贮备液Ⅰ,以及黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸质量浓度分别为31.00、63.40、24.40、99.60 μg/mL 的贮备液Ⅱ,将上述2 种贮备液等量混合,即得(黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸质量浓度分别 为 412.60、72.20、15.50、31.70、12.20、49.80 μg/mL),置于4 ℃冰箱中避光保存。

2.1.2 供试品溶液 取炙麻黄4.5 g、石膏20 g、杏仁9 g、桑白皮9 g、黄芩9 g、细辛3 g、皂角刺4.5 g、干姜3 g、豆蔻2 g、甘草6 g,粉碎后过3号筛,精密称取0.25 g,置于100 mL 圆底烧瓶中,加入20 mL 甲醇,在80 ℃下回流提取2 次,每次0.5 h,合并2 次提取液,放冷,转移至50 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,0.45 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.1.3 阴性样品溶液 分别取缺细辛、缺黄芩、缺干姜、缺甘草的阴性样品,按“2.1.2” 项下方法制备,即得。

2.2 色谱条件与系统适用性试验 Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);
流动相水(含0.1%甲酸)(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0~15 min,45%~48% B;
15~27 min,48%~60% B;
27~43 min,60%~68%B;
43~48 min,68%~71%B;
48~55 min,71% B);
体积流量1.0 mL/min;
柱温30 ℃;
检测波长0~33 min 275 nm,33~40 min 280 nm,40~49 min 285 nm,49~55 min 250 nm;
进样量10 μL。理论塔板数按各成分色谱峰计算,不低于4 000,并且各成分分离度应不小于3.0。

2.3 专属性考察 精密吸取空白溶剂及对照品、供试品、阴性样品溶液适量,在“2.2” 项色谱条件下进样测定,结果见图1。由此可知,空白溶剂、溶液中杂质不干扰测定;
阴性样品溶液在对照品相应保留时间处无吸收,表明其他药味对测定无影响,该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 取“2.1.1” 项下对照品溶液适量,制成系列质量浓度,在“2.2” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验

2.5.1 日内精密度 精密吸取同一份对照品溶液10 μL,同一天内在“2.2” 项色谱条件下进样测定5 次,测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸峰面积RSD 分别为0.16%、0.27%、0.42%、1.72%、1.46%、0.69%,表 明该方法日内精密度良好。

2.5.2 日间精密度 精密吸取同一份对照品溶液10 μL,每天在“2.2” 项色谱条件下进样测定5次,连续3 d,测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸峰面积RSD 分别为0.48%、0.55%、1.01%、1.62%、2.84%、1.04%,表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液10 μL,于0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h在“2.2” 项色谱条件下进样测定,测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸峰面积 RSD 分别为2.29%、1.51%、1.53%、2.06%、1.90%、2.55%,表明溶液在72 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取同一批本品粉末6 份,按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.2”项色谱条件下进样测定,测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸含量RSD分别为1.65%、1.82%、1.75%、1.85%,1.92%、2.78%,表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品粉末0.125 g,共9 份,每3 份1 组,分别加入高、中、低质量浓度(分别为已知含量的80%、100%、120%)的对照品溶液,每个质量浓度3 份,按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.2” 项色谱条件下进样测定,计算回收率。结果,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸平均加样回收率分别为93.14%、98.48%、99.09%、100.36%,98.86%、93.98%,RSD 分别为2.54%、2.43%、2.59%、2.78%,2.60%、2.78%。

2.9 样品含量测定 取3 批样品粉末,按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液,每批平行2份,在“2.2” 项色谱条件下各进样测定2 次,外标法计算含量,结果见表2。

表2 各成分含量测定结果(n=3)Tab.2 Results of content determination of various constituents(n=3)

课题组前期采用HPLC-QTOF/MS 法对五虎汤加味进行分析,鉴定出苦杏仁苷、麻黄碱、伪麻黄碱、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、桑根酮C、桑根酮D、甘草苷、甘草酸、6-姜辣素、细辛脂素等化合物,根据其极性、酸碱性、含量等差异,建立包含2 种条件的HPLC 法分别测定上述成分含量[14-16]。本实验报道了黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、6-姜辣素、细辛脂素的含量测定方法,后续将以乙腈-0.1%磷酸(含0.1%三乙胺)为流动相,测定苦杏仁苷、麻黄碱、伪麻黄碱等成分含量。

本实验根据各成分紫外吸收图谱,选择在275 nm波长处检测黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素,280 nm 波长处检测6-姜辣素,285 nm 波长处检测细辛脂素,250 nm 波长处检测甘草酸,实现了6 种成分含量的同时测定。在流动相筛选过程中,本实验考察乙腈-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.1%甲酸)等系统,发现以后者洗脱时色谱峰峰形最好,基线噪音最低。再考察不同体积流量、柱温对各成分色谱峰分离度的影响,发现两者微小变化对测定结果影响不大,表明该方法具有良好的耐用性。

本实验建立HPLC 法同时测定五虎汤加味中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、6-姜辣素、细辛脂素、甘草酸的含量,该方法精密稳定,适用性、可靠性良好,可用于该方质量控制。

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