转化生长因子β1在宫腔粘连中的研究进展

李光璨，翟超，张晓轩，任春娥

宫腔粘连（intrauterine adhesions，IUA）亦称Asherman综合征[1]，是指由于子宫内膜基底层受损，宫腔内形成局部纤维化组织，进而引起子宫内膜表面相互粘连、宫腔部分或完全闭塞。目前认为，有创宫腔操作是导致IUA的最主要因素，此外，宫腔感染、生殖器结核等病理状态也会对子宫内膜组织的功能产生影响[2]。IUA是一种纤维化疾病，实质是大量的子宫内膜被纤维性组织取代[3]，且大多数情况下还可能伴随过度炎症反应及血管闭塞萎缩，使子宫内膜失去原有的血液供应，生长缓慢，甚至丧失正常的生理功能。IUA的临床表现主要有月经改变、不孕及妊娠丢失、反复胚胎种植失败等，严重影响育龄期女性的生殖健康。目前IUA的治疗方式主要为宫腔镜下宫腔粘连分离术（transcervical resection of adhesion，TCRA），宫腔镜下冷刀分离术是近年来的新兴术式，相较于传统的宫腔镜下电切术而言，其手术创伤小且无电热辐射，可有效避免子宫内膜的继发性损伤，减轻组织炎性反应，且在术后辅以预防粘连复发的措施，如宫腔内放置透明质酸钠、口服雌孕激素等，更有助于IUA的控制与恢复。尽管采用了诸多预防术后再粘连的方法，但术后的IUA复发率仍较高，重度IUA的复发率甚至高达20%～62.5%[4]。因此，阐明IUA形成的分子机制，对防止IUA术后复发、提高妊娠率及活产率具有重要意义。但IUA的发病机制目前尚未明确，纤维细胞增生活跃学说认为其本质是子宫内膜纤维化，因此，研究纤维化相关因子及其信号通路与IUA之间的关系尤为重要。转化生长因子β1（transform growth factor-β1，TGF-β1）是目前已知最重要的促纤维形成细胞因子，已成为细胞纤维化的重要标志，学者们认为TGF-β1与IUA的发生关系密切。现就TGF-β1及其相关通路在IUA纤维化方面的研究进展进行综述。

TGF-β超家族是一组具有多效性和复杂性的细胞因子，有活性的TGF-β超家族分子皆为2个亚基通过二硫键结合形成的同源或异源二聚体。目前根据其在机体发育中发挥的作用将TGF-β超家族成员分为TGF-β亚型（TGF-β1/2/3）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、生长分化因子（growth differentiation factor，GDF）、激活素（activin）、抑制素（inhibin）和抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）等[5]。它们在调节细胞增殖分化、内环境稳定、免疫反应及细胞外基质产生等方面发挥重要作用，各成员间既存在协同作用又有拮抗作用，构成一个复杂而又精细的调控网络，倘若超出其代偿范围出现炎症、纤维化和肿瘤等情况时，常可检测到家族某些分子的异常表达。

2.1 TGF-β/Smad信号通路TGF-β具有3种亚型（TGF-β1/2/3），它们虽然由3种不同的基因编码，但是通过相同的信号系统发挥作用。TGF-β1主要在内皮、造血和结缔组织细胞中表达，TGF-β2在上皮细胞和神经元细胞中表达，而TGF-β3主要在间充质细胞中表达。TGF-β具有3种受体，其中Ⅰ型和Ⅱ型受体是由丝氨酸和苏氨酸激酶组成的跨膜受体复合物，Ⅲ型受体主要负责增加前两者的结合亲和力。Smad蛋白位于TGF-β/Smad信号通路下游，在该通路信号转导及转录调控中发挥重要作用，大致可分为3类：调节型Smad（R-Smad）、共同通路型Smad（Co-Smad）和抑制型Smad（I-Smad）[6]。在TGF-β经典信号通路中，TGF-β配体通过结合细胞膜表面的Ⅰ型和Ⅱ型受体触发信号传导[7]。首先与Ⅱ型受体结合成为活化型，由于Ⅱ型受体具有持续的磷酸激酶活性，因此Ⅰ型受体与之结合后可被激活，形成的受体复合物可与R-Smad发生短效磷酸化，随后RSmad与受体复合物分离与Co-Smad相互作用，并以复合物的形式进入细胞核，并在细胞核内对TGF-β超家族Smad依赖性信号途径发挥调节或抑制作用。抑制型调节因子可以阻断R-Smad与Ⅰ型受体结合的作用，或增强受体的降解作用，从而阻断TGF-β1的信号传导[8]。

2.2 TGF-β1/Smad信号通路与组织纤维化众所周知，TGF-β1在组织器官纤维化的发展过程中具有重要作用，有众多实验表明TGF-β1在纤维化器官中的表达显著上调，是一种高效的促纤维化调节因子。其具有多种生物功能，如调节细胞生长、分化和凋亡，促进细胞外基质的分泌及沉积，并可诱导上皮-间质转化，增强并维持促纤维细胞的活力。有研究表明TGF-β1/Smad通路参与了组织纤维化的过程[9]。该通路与人的心脏、肺、肝脏和肾等多种器官的纤维化有关。TGF-β1是肝脏中最重要的致纤维化细胞因子，TGF-β1/Smad信号通路的激活会抑制肝实质细胞的再生[10]，在加重纤维化的同时还会产生大量结缔组织生长因子，加重细胞外基质沉积，导致肝纤维化。另有研究表明，在肺纤维化过程中TGF-β1/Smad信号通路被激活，促使成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，肺泡上皮细胞和内皮细胞向间充质细胞转化[11]，减少或抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）的分泌，导致大量细胞外基质无法正常降解，使其在肺部积聚引起肺纤维化。

2.3 TGF-β1/Smad信号通路与炎症反应 机体在遭受创伤或持续处于感染状态时，会刺激炎症细胞形成并释放大量炎症因子。如在肾脏中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的高表达会导致组织纤维化，加剧肾脏恶化的同时会刺激机体发生更剧烈的炎症反应，白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）通过激活中性粒细胞释放炎症介质，而TGFβ1可以通过激活TGF-β1/Smad信号通路进一步促进两者的表达[12]。Qiao等[13]的研究表明，TGF-β1的低表达可以抑制炎症反应并阻止纤维化进展。通过研究人类子宫内膜标本和动物模型发现，在IUA形成过程中，TGF-β1/Smad信号通路的激活不仅可以启动下游一系列信号通路促进纤维化，同时还刺激多种与炎症相关的因子，如MMP-9、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、血 管 内 皮 生 长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等，它们均能够通过TGF-β1/Smad信号通路参与炎症及促纤维化反应。其机制主要为感染、创伤使子宫内膜基底层受损，激发炎症反应的同时还可能伴随子宫内膜血管及雌激素受体部分或完全缺失，使子宫内膜周期性修复功能受到影响，并启动自发性纤维性修复，引起IUA的发生。

3.1 TGF-β1/Smad通路在IUA中的表达Xue等[14]研究证实IUA患者子宫内膜组织中TGF-β1的表达显著高于非IUA患者，提示TGF-β1通路参与了子宫内膜纤维化过程，在IUA发病机制中发挥着重要作用。其机制主要为TGF-β1/Smad信号传导引起成纤维细胞增殖和组织纤维化[15]。且在成纤维细胞TGFβ1信号传导过程中，Smad3比Smad2的作用更为关键和重要[16]。有研究发现，在重度粘连子宫内膜组织中，TGF-β1、Smad3/4的表达显著上调，而Smad7表达明显下调，且TGF-β1与Smad3/4表达水平呈正相关，与Smad7表达水平则呈负相关，这说明在TGFβ1/Smad信号通路中，Smad3过度正调控和Smad7负调控不足均可能并影响IUA的发生、发展[17]。

3.2 TGF-β1在IUA中的调控机制TGF-β家族主要通过Smad信号通路影响细胞生命活动，也可激活其他信号通路交叉发挥作用，或作为对Smad途径的补充途径对细胞活动进行调节。

3.2.1 TGF-β1与Wnt Wnt相关信号通路对于促进细胞增殖、维持组织稳态起到关键作用，在一定条件下可以调节干细胞的更新及分化[18-19]。在子宫内膜中，该信号通路可以有效促进子宫内膜组织的生长及修复。Garcia-Alonso等[20]研究发现Wnt信号在增殖期子宫内膜中呈现明显的增强趋势，而该信号通路活性在分泌期则受到明显抑制，这可能与Wnt与雌、孕激素之间产生复杂的交互作用有关，提示Wnt信号通路深度参与调节子宫内膜的周期性变化。目前研究认为，Wnt信号通路与纤维化疾病密切相关，而TGF-β1是激活经典Wnt信号通路的主要刺激物，促使其激活成纤维细胞、促进细胞外基质成分的释放，两者联合在组织纤维化过程中发挥重要作用[21]。有研究探讨TGF-β1及Wnt/β联蛋白（β-catenin）信号通路对子宫内膜基质细胞的影响，结果显示，TGFβ1有效诱导了Wnt信号通路相关分子的表达、促进了子宫内膜基质细胞纤维化，同时Wnt信号通路配体（Wnt3a）联合TGF-β1诱导组的促纤维化作用较单一诱导组效果更为显著[22]。Liu等[23]研究发现，通过干扰TGF-β1作用于Wnt信号通路的靶点可以显著抑制TGF-β1对子宫内膜细胞的纤维化作用。最近的一项研究结果亦证实，通过靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路可以抑制TGF-β1诱导的上皮-间质转化过程，下调Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及纤维连接蛋白等细胞外基质成分的表达，而应用Wnt/β-catenin通路激动剂则逆转了这一现象[24]。TGF-β1与Wnt信号通路之间的关联串扰是促进子宫内膜纤维化及发生IUA的重要机制，然而Wnt信号通路在促进子宫内膜纤维化形成、参与IUA病理过程的同时，还参与了子宫内膜的修复过程，该通路与雌激素协同具有促进子宫内膜增殖的作用，并可诱导子宫内膜干细胞的分化，有望用于治疗IUA。

3.2.2 TGF-β1与NF-κB NF-κB是一种重要的转录因子，其相关通路在介导机体炎症反应、细胞分化、氧化应激等生物过程中发挥重要作用。静息状态下，NF-κB主要存在于细胞质中，并与NF-κB抑制蛋白稳定结合。当机体处于应激状态时，NF-κB发生磷酸化，激活后被释放转移至细胞核内，启动下游炎性因子（如TNF-α、IL-1）的转录合成，而上述炎性因子又以正反馈的方式持续刺激NF-κB发挥作用，加速促炎症反应发生[25]。早期研究证实，在肾纤维化组织中存在TGF-β1介导的NF-κB通路的异常激活[26]。Conlon等[27]发现，应用淋巴毒素β受体抑制剂可有效抑制NF-κB的非经典激活，同时减弱TGF-β的信号传导，改善气道纤维化。这提示在不同器官纤维化疾病中NF-κB介导的炎症反应与TGF-β介导的组织纤维化有关。既往研究发现，在IUA患者的子宫内膜组织中，TGF-β的表达及NF-κB信号通路的活性均显著增强，且NF-κB通路活性与TGF-β的表达程度呈正相关，进一步的实验通过阻断NF-κB信号通路实现了对TGF-β表达的抑制[14]。Hua等[28]对IUA家兔模型进行研究，结果显示应用人脐血间充质干细胞能有效抑制NF-κB亚基P65蛋白的表达，减弱受损子宫内膜的炎症反应，下调TGF-β1表达，达到改善子宫内膜纤维化的目的。综上所述，在子宫内膜微环境异常的情况下，TGF-β1和NF-κB通路可以通过相互作用加剧组织的炎症反应，诱导纤维化产生，这提示未来或许可以通过靶向抑制NF-κB/TGF-β1通路诱发抗纤维化和抗炎效应，但目前两者之间复杂的调控机制仍有待进一步探索。

3.2.3 TGF-β1与Hippo Hippo通路是一类进化上高度保守的信号通路，在调节组织生长发育、维持内环境稳态及平衡免疫状态中发挥关键作用，学者们认为其与组织纤维化、肿瘤发展及伤口修复过程密切相关[29]。YAP和TAZ是Hippo通路主要的下游效应分子，在子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中，激活的Hippo通路可以触发YAP/TAZ的磷酸化过程，限制其进入细胞核发挥转录作用，从而抑制上皮-间质转化。目前普遍认为，Hippo信号通路及其效应分子深度参与组织纤维化过程。Mooring等[30]研究发现，在肝细胞中增加Hippo通路的YAP活性可以增加肌成纤维细胞的活性，加速上皮-间质转化，同时促进炎性因子（IL-1、TNF）的表达。之前的一项研究表明，YAP或TAZ能通过稳定修饰染色体结构促进心脏的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，这一过程亦伴随着细胞外基质成分表达的上调。而进一步的实验结果显示，干扰YAP介导的转录活动可显著抑制TGF-β1诱导的肌成纤维细胞活性，从而降低组织的纤维化程度[31]。Smad作为与TAZ结合的蛋白之一，同样受到激活的Hippo通路的影响。通常情况下，YAP/TAZ可以与TGF-β1通路下游的Smad2/3相结合，促使其在细胞核中发挥转录调控作用，而激活Hippo通路能够显著抑制YAP/TAZ的活动，继而对TGF-β1通路所介导的纤维化过程产生负性调节作用[32]。Zhang等[33]研究发现，应用经血源性基质细胞可以显著改善IUA大鼠的子宫内膜生长及血管生成情况，或许与通过激活Hippo通路减弱了子宫内膜纤维化及炎症反应有关。已有大量研究证实了TGF-β1和Hippo通路在促纤维化过程中的相互作用关系，或许能够为IUA的多靶点治疗方式的开发提供新思路。

3.2.4 TGF-β1与MMP-9 MMP是自然界进化中高度保守的一类蛋白酶，属于细胞外基质的降解酶之一，细胞外基质生成及降解之间的动态平衡是维持组织稳态、防止异常纤维化的重要一环，而MMP对细胞外基质的正常降解在其中起到至关重要的作用[34]。MMP-9主要参与胚胎发生、伤口愈合及纤维化等过程。已有研究表明，IUA患者子宫内膜中的激酶插入区受体（kinase insert domain containing receptor，KDR）水平与IUA的严重程度呈正相关，沉默KDR后TGF-β1/Smad通路受到极大抑制，在MMP-9表达明显升高的同时子宫内膜的纤维化程度降低，提示在IUA的发生、发展过程中，TGF-β1与MMP-9之间的表达存在相关性[35]。一项前瞻性临床试验结果显示，TCRA术后的IUA患者子宫内膜组织中TGF-β1表达高于对照组，MMP-9表达低于对照组，说明TGF-β1与MMP-9共同参与了IUA的形成与发展，且可以初步推测TGF-β1与MMP-9的表达水平呈负相关[36]。赵芳芳等[37]用过氧化氢（H2O2）处理人子宫内膜基质细胞，诱导建立氧化应激模型，发现相较于空白组，H2O2组细胞中TGF-β1表达水平显著升高，而MMP-9表达显著降低；
反之，当抑制TGF-β1表达时，MMP-9的表达明显增强。提示TGF-β1可能通过抑制MMP-9的表达降低纤维蛋白的溶解，促进了子宫内膜纤维化的发生并最终导致IUA。但有研究通过构建大鼠IUA模型观察Smad3抑制剂（SIS3）对大鼠IUA相关因子表达的影响，结果却显示模型组MMP-9的表达水平高于对照组，但与IUA纤维化程度及TGF-β1的表达无明显相关性[38]。这与前述的实验结论不一致，可能是因为该实验受到样本数量及检测方法的限制，也可能是因为MMP-9的表达并不绝对依赖于TGF-β1引导的纤维化过程，而是与子宫内膜受损后引起炎症反应使大量炎症细胞聚集产生MMP-9有关，具体机制有待深入研究。在IUA的发生过程中，TGF-β1与MMP-9的相关性需要更多的实验数据来验证，或许利用两者之间的交叉对话可以获得更为精准有效的治疗方法。

3.2.5 TGF-β1与CTGF CTGF是CCN多肽家族的一种多功能蛋白，可诱导成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质，具有调节细胞增生分化、胚胎发育及伤口愈合等功能，能够作为TGF-β、NF-κB等信号通路的下游效应因子参与调节炎症、创面愈合及瘢痕形成等生物学过程。目前普遍认为，CTGF可以刺激Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的产生，诱导细胞外基质的合成，且其作为上皮-间质转化调节的启动子，可以与TGF-β1协同促进组织的纤维化进程[39]。有研究发现，TGF-β可以通过将促纤维化信号传递给Smad通路的方式来激活CTGF转录，而敲除CTGF因子后可显著抑制TGF-β诱导的促纤维化反应[40]。李灿宇等[38]的研究表明，TGF-β1、CTGF可作为IUA的潜在分子标志物，两者与IUA严重程度呈正相关，应用SIS3抑制TGF-β1/Smad信号通路可显著减弱该通路对CTGF的诱导作用，进而减轻IUA。宗实等[41]的研究进一步证实了上述观点，TGF-β1通过上调下游CTGF基因的表达，可调控结缔组织增生，用VEGF基因修饰的间充质干细胞治疗的大鼠子宫内膜小血管数量及腺体数量均优于未治疗组，TGF-β1及CTGF的表达亦显著降低，且伴有子宫内膜再生修复和IUA的显著改善。因此，阻断或抑制CTGF表达或许可以成为治疗子宫内膜纤维化的潜在治疗靶点，为子宫内膜的再生修复提供更有效的治疗方式。

TGF-β1与诸多信号通路之间存在着复杂的调控关系，它们在IUA发生发展的多个重要环节中起关键作用。IUA在临床上较为常见，但子宫内膜纤维化是一个复杂的病理过程，目前针对TGF-β1参与的发病机制仍需深入研究，明确上述复杂的调控过程，使未来应用抗TGF-β1抗体及相关通路抑制剂阻止子宫内膜纤维化进展成为可能。但目前的研究表明TGF-β1的表达机制复杂且作用广泛，现有的靶向药物难以对其实现精准调控，且容易对其他脏器产生较大的不良影响，尚无法广泛应用于临床，因此找出TGF-β1及其相关信号通路在子宫内膜纤维化过程中精确的作用靶点，将为今后开发更高效、更安全的特异性药物提供新的研究策略，并为有效预防IUA的发生探索出更具特异性的治疗方案。

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