AHNAK2与甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移以及预后的相关性分析

李建东，殷 涛，李卓良 (简阳市人民医院普外科，四川 简阳 641400)

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是分化型甲状腺恶性肿瘤中最常见的组织学类型，具有高度分化、恶性低和生长缓慢的特点，临床预后良好，但部分患者在诊断时已发生局部邻近组织甚至远处转移，需要接受手术、术后放射性碘消融和促甲状腺激素抑制等综合治疗，尽管多数患者可获得较为满意的预后，但仍有部分患者最终进展为难治性PTC，易复发，甚至死亡[1]。颈部淋巴结是PTC常见的转移部位，发生率为40%～90%，一旦发生颈部淋巴结转移，PTC的复发率将显著增高[2]。Ahnak核蛋白2(Ahnak nuclear protein 2，AHNAK2)是一个潜在的致癌基因，在肾透明细胞癌、胰腺导管腺癌、葡萄膜黑色素瘤和肺腺癌中高表达，且与预后不良有关[3]。但目前AHNAK2在PTC中的表达情况及其临床意义尚不清楚。鉴于此，本研究拟检测PTC组织中AHNAK2的表达情况，分析AHNAK2与PTC颈部淋巴结转移和预后的关系，以期为临床PTC的治疗和预后判断提供参考。

1.1 临床资料

回顾性分析2016年1月至2021年12月我院普外科收治的115例PTC患者(PTC组)的临床资料，其中男42例，女73例；
年龄23～72岁，平均(45.03±12.12)岁；
肿瘤直径0.1～6.0 cm，平均(1.34±0.22)cm；
单侧73例，双侧42例；
单发64例，多发51例；
分化程度：低中度分化30例，高度分化85例；
TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期79例，Ⅲ～Ⅳ期36例；
发生颈部淋巴结转移43例，合并桥本氏甲状腺炎21例；
微钙化65例，低回声实性结节63例，边缘浸润36例。所有患者术前进行甲状腺结节和颈部淋巴结超声评估，单侧PTC行单侧甲状腺叶切除+峡部切除术+同侧中央淋巴结清扫术，峡部或双侧PTC行全甲状腺切除术+双侧中央淋巴结清扫术，术前影像学检查发现或细针抽吸细胞学证实侧颈部淋巴结转移并行功能性侧颈部淋巴结清扫术，术中行冷冻切片的组织学检查。纳入标准：①初次接受甲状腺手术并经病理证实为PTC；
②年龄18周岁以上；
③定期接受随访。排除标准：①其他类型甲状腺恶性肿瘤；
②未行中央淋巴结清扫术；
③有甲状腺手术史；
④资料不完整，随访失联。另选择33例经病理证实的良性甲状腺结节患者作为对照组，均行手术治疗，组织标本保存完好，其中男12例，女21例；
年龄23～69岁，平均(45.51±11.43)岁。2组患者年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已经获得我院伦理委员会批准(PZ051021)。

1.2 免疫组织化学法检测AHNAK2表达

取手术切除的甲状腺组织，放入含0.3%过氧化氢的甲醇溶液中浸泡30 min，磷酸盐缓冲盐水洗涤，加入AHNAK2一抗(PBS 1∶100稀释，17682-1-AP，山羊抗兔多抗，美国Proteintech Group,Inc公司)，4 ℃孵育过夜，弃掉一抗，磷酸盐缓冲盐水洗涤，加入羊抗兔Alexa Flour Plus 488标记二抗(美国赛默飞公司)，37 ℃恒温箱内孵育20 min，弃掉二抗，磷酸盐缓冲盐水洗涤。二氨基联苯(福州迈新生物科技有限公司)显色5 min，清洗，酒精和二甲苯脱水，永久培养基固定，光学显微镜下阅片拍照。IHC评分以染色强度和染色细胞占比进行评估，染色强度评分：0分表示阴性，1分表示弱阳性，2分表示阳性，3分表示强阳性；
以良性肿瘤细胞占比对染色程度进行评分：无染色细胞为0分，染色细胞占1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分，两个分数相乘得到IHC评分，0～4分为低表达，>4分为高表达[4]。

1.3 随访和相关资料收集

所有患者术后电话随访至2022年6月，统计随访期间PTC复发和患者死亡情况。统计PTC患者性别、年龄、肿瘤直径、PTC侧别、PTC数量、TNM分期、分化程度、颈部淋巴结转移(中央区、侧颈区)、桥本氏甲状腺炎、甲状腺超声特征(包括微钙化、低回声实性结节、边缘浸润)、术中清扫范围等临床资料。

1.4 统计学分析

2.1 PTC组织和正常甲状腺组织中AHNAK2表达

AHNAK2阳性表达主要定位于细胞膜，PTC组AHNAK2高表达率为62.61%(72/115)，高于对照组的27.27%(9/33)，差异有统计学意义(χ2=12.923，P<0.05)，见图1。

a：PTC(×40)；
b：正常甲状腺组织(×200)图1 PTC和正常甲状腺组织中AHNAK2表达

2.2 不同临床特征的PTC患者间AHNAK2高表达比较

PTC患者中微钙化、低度分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、颈部侧颈区淋巴结转移患者的AHNAK2高表达率高于无微钙化、中高度分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和无颈部侧颈区淋巴结转移的患者(P<0.05)，不同年龄、性别、肿瘤直径、甲状腺超声特征患者间AHNAK2高表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同PTC患者临床特征AHNAK2高表达比较[例(%)]

2.3 不同AHNAK2表达的PTC患者无复发生存率比较

所有患者均完成随访，中位随访时间32(6～65)个月，随访期间无患者死亡，20例复发，其中淋巴结复发18例(11例中央区复发、7例颈侧区复发)，甲状腺复发2例;8例发生于术后15～24个月，11例发生于术后25～36个月，1例发生于术后50个月。根据ANHAK2表达情况将PTC患者分为高表达组(72例)和低表达组(43例)，绘制Kaplan-Meier曲线，经检验，高表达组无复发生存率低于低表达组(9.30%vs.26.39%，Log-rankχ2=5.028，P<0.05)，见图2。

图2 不同AHNAK2表达PTC患者无复发生存的Kaplan-Meier曲线

2.4 影响PTC患者术后复发的因素分析

将年龄(0=≤45岁，1=>45岁)、性别(0=男，1=女)、肿瘤直径(0=≤1.0 cm，1=>1.0 cm)、微钙化(0=否，1=是)、低回声实性结节(0=否，1=是)、边缘浸润(0=否，1=是)、PTC侧别(0=单侧，1=双侧)、PTC数量(0=单发，1=多发)、桥本氏甲状腺炎(0=否，1=是)、分化程度(0=中高度分化，1=低度分化)、TNM分期(0=Ⅰ～Ⅱ期，1=Ⅲ～Ⅳ期)、颈部中央区淋巴结转移(0=否，1=是)、颈部侧颈区淋巴结转移(0=否，1=是)、术中淋巴结清扫范围(0=中央区淋巴结清扫，1=侧颈部淋巴结清扫)、AHNAK2作为自变量，以PTC患者术后是否复发为因变量(0=否，1=是)，向后逐步法排除无关变量(P>0.05)，单因素Cox回归结果显示微钙化、分化程度、TNM分期、颈部侧颈区淋巴结转移、AHNAK2表达与PTC患者的术后复发有关(P<0.05)，见表2。将单因素分析中具有统计学差异变量纳入多因素Cox回归方程，向后逐步法排除无关变量(P>0.05)，结果显示，颈部侧颈区淋巴结转移、AHNAK2高表达是PTC患者术后复发的危险因素(P<0.05)，见表3。

表2 影响PTC患者术后复发的单因素Cox风险比例回归方程

表3 影响PTC患者术后复发的多因素Cox风险比例回归方程

甲状腺癌是最常见的一种恶性内分泌肿瘤，占人类所有恶性肿瘤的1%，占头颈部恶性肿瘤的33%[2，5]。PTC是甲状腺癌中最常见的病理类型，占所有甲状腺癌的80%～85%[2]，PTC早期易发生颈部淋巴结转移，引起肿瘤复发[6]，一旦复发再次手术相对困难，可能会显著增加手术并发症，从而影响患者的生活质量，降低患者生存率[7]。因此，术前准确评估颈部淋巴结状态有助于降低PTC复发率，改善患者预后。

本研究发现AHNAK2高表达与PTC患者微钙化、低度分化、TNM分期的临床特征、颈部淋巴结转移以及术后复发有关，AHNAK2高表达是PTC患者术后复发的危险因素，可见AHNAK2在PTC的发病机制中发挥致癌基因作用，AHNAK2高表达可能促进PTC癌细胞的恶性增殖和侵袭等。AHNAK2属于AHNAK家族成员，位于染色体14q32上，包含5 795个氨基酸，主要定位于各种细胞类型的细胞核、细胞质和质膜，包括N端PDZ结构域、中央重复单元区和C端结构域，在调节血脑屏障形成、细胞迁移、心脏钙通道信号传导中发挥重要作用[8]。AHNAK2被认为是一种致癌蛋白，既往研究显示，AHNAK2在肺腺癌组织样本中表达上调，且与肺腺癌患者的预后不良有关，其在体外通过转染si-AHNAK2抑制丝分裂原活化蛋白激酶通路相关蛋白表达后，肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭均受到抑制[9]；
AHNAK2还可通过激活转化生长因子-β诱导的Smad3信号传导促使上皮间质转化，诱导肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[10]。AHNAK2能诱导磷脂酰肌醇3-激酶信号通路激活，促进葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭[11]，或通过靶向透明细胞肾细胞癌中的缺氧诱导因子1-α介导缺氧途径促使上皮间质转化，促进肿瘤进展[12]。

AHNAK2参与PTC颈部淋巴结转移以及术后复发的机制目前尚不清楚，分析可能包括以下几方面：首先，AHNAK2作为一种支架蛋白，与电压门控钙通道相关，其C端结构域末端与Ca2+通道的β2和β1a同工型相互作用，促使蛋白激酶A磷酸化，进而限制Ca2+内流。Ca2+是内皮细胞中必不可少的第二信使，参与调节细胞迁移、血管生成、屏障功能和炎症等多种生理过程，细胞内Ca2+浓度增加可导致黏附连接解体和细胞骨架重排，促进内皮细胞收缩，增加血管通透性，同时促使白细胞-内皮细胞相互作用，驱使白细胞黏附和跨内皮迁移[13]。AHNAK2可能通过促使细胞黏附、细胞连接参与免疫调节过程，AHNAK2高表达可能导致PTC癌组织中B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等免疫细胞浸润，进而促使肿瘤细胞的侵袭和转移[14]。其次，核因子-kappa B(NF-κB)是调节炎症以及调控癌变和癌症进展的重要因子，NF-κB可诱导snail、twist和锌指E盒结合的同源盒蛋白2等多种转录因子表达，促进上皮间质转化，促使PTC淋巴结转移，增强其侵袭功能[15-16]，同时，AHNAK2表达上调可激活NF-κB信号通路，诱导上皮间质转化，促使PTC颈部淋巴结转移和术后复发[17]。最后，Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路激活可上调增殖基因-细胞周期蛋白D1表达并介导细胞-细胞黏附的跨膜蛋白-E-钙黏蛋白表达，促使PTC细胞增殖、侵袭和迁移[18]，AHNAK2可能通过激活Wnt/β-catenin通路，上调细胞周期蛋白D1表达，促使上皮间质转化，进而促进PTC细胞增殖和转移[19]。本研究回归分析结果显示，颈部侧颈区淋巴结转移与PTC术后复发也有关，颈部侧颈区淋巴结转移患者AHNAK2高表达率高于无颈部侧颈区淋巴结转移患者，表明颈部侧颈区淋巴结转移与更高的PTC癌细胞侵袭性和复发风险有关。

综上，PTC组织中AHNAK2表达上调，AHNAK2高表达与PTC患者微钙化、低度分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、颈部侧颈区淋巴结转移和术后复发有关，是PTC预后的潜在标志物。本研究创新之处在于阐述了AHNAK2与PTC颈部淋巴结转移和术后复发的关系，但为回顾性研究，样本量偏少，尚待进一步开展前瞻性大样本临床研究证实。

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