不同月龄獭兔皮肤组织切片的观察与研究

赵俊皓，武志锋，黄卫国，王新强，段 伟，李奋军，王志龙，王全亮

(酒泉市畜牧兽医总站，甘肃 酒泉 735000)

皮肤在维持机体内环境稳态和预防外来物入侵中发挥着不可替代的作用。就皮毛两用动物来说，皮毛有着极其重要的经济价值，为了提高其利用价值，科技工作者对部分常见的皮毛动物的皮肤及毛囊的发育过程和特点，都进行了大量的钻研，前期诸多研究多集中在山羊、绵羊及模式动物小鼠上，獭兔是典型的皮肉兼用型经济动物，现阶段对于不同发育时期的獭兔，它的毛囊以及皮肤的形态变化研究资料极为稀少。

獭兔皮毛属于轻薄类、外观自然美观，近年来兔皮在国内及国际市场上都占有很大份额，价格长期高位运行。为获得高品质兔皮，除了优代品种和精细化管理外，特别应该注意采皮的适宜月龄和季节选取，配合安排优化繁殖从而提高兔皮质量等级，使得养殖效益得到明显提升。但在实际养殖过程中，因为受到疾病、营养、、应急等其他原因，獭兔的皮肤发育很容易受到影响，从而影响兔皮的高质量。本试验通过对不同月龄獭兔皮肤组织切片的制作及观察，为提高兔皮质量提供科学有效的采皮参考依据。

1.1 材料

2、4、5月龄獭兔各1只、切片石蜡(60～62℃)，准备好生理盐水，10%甲醛溶液，1%盐酸酒精溶液，HE染色剂，乙醇，二甲苯，蒸馏水，中性树胶，Motic 数码显微镜(BA210),Bluepard 电热鼓风干燥箱(DHG-9140A)，Leica连续切片机(RM2235)，Kedee 生物组织摊片机(KD-P)，Kedee 生物组织烘片机(KD-H), Motic 数码显微镜(SFC-28)。

1.2 方法

1.2.1 取样 选择不同月龄健康獭兔3只，以月龄作为分组依据。处死后，在每只獭兔十字背部、臀部各选取一块2 cm大小皮肤块，用生理盐水进行冲洗后，分别放入盛有10%甲醛溶液的已编号广口瓶中24 h。

图1 采皮(十字交叉处取样)

1.2.2 逐级脱水 第一步75%酒精进行2 h，第二步85%酒精1 h，第三步95%酒精1 h，第四步100%酒精90 min。

1.2.3 透明和浸蜡 组织样本先进行脱水，准备好后第一步浸入二甲苯I(二甲苯:酒精=1:1)30 min，第二部浸入二甲苯II(纯二甲苯)5 min，第三步浸入二甲苯III(二甲苯:石蜡=1:1)5 min，第四步浸入熔化的切片石蜡(60～62℃)2.5 h，按顺序依次进行。

1.2.4 包埋 为保证石蜡不发生外溢现象可以涂抹凡士林。将之前包埋好的石蜡，连同浸蜡组织块一并放入在有石棉网的电炉，持续加热。后倒入很少量的石蜡，迅速移至框架内，二次倒满石蜡，等待凝固下一步使用。

1.2.5 切片、贴片 6℃环境中置入包埋片，过夜。在预制好的包埋块底端酒精灯持续加热，待融化后与木块焊接。可使用酒精灯加热镊子，焊接牢靠。对包埋块进行修整，确保样品暴露在外且两侧处于平行。片机刀刃与蜡块表面角度成5°倾斜，正夹角下刀切割。此操作务必使用锋利的刀片，不可使蜡带产生波纹。将切割好的蜡带放入40℃蒸馏水进行展片，用手指轻轻涂匀明胶粘片剂，后用载玻片黏出切片，使蜡带处于玻片的中央处。将组装好的切片置于温箱中进行烘干，温度低于60℃、0.5h，温度不可过高否则会造成切片脱片或产生气泡或，影响实验结果。

1.2.6 染色 使用普通HE染色法进行染色，开始前先用二甲苯I、Ⅱ脱蜡各15 min，根据季节调整时间，冬季脱蜡要略长，夏季可稍短，时间宁长勿短，如脱蜡不净会影响染色。脱蜡酒精浸润用水冲洗干净，置酸化液中酸化5 min。苏木精深染，一般建议为5 min。再用1%盐酸酒精不间断分化5s进行染色，蓝化变化是否明晰，最后一步使用水洗去除分化液脱下的染料，分化效果在此步骤停止。返蓝则选取自来水、持续冲洗15 min，后可在显微镜下观察核是否清楚，如不清则适当延长冲洗时间，后经伊红染1～2 min，伊红染胞浆，进行充分水洗至少30s，最终使用85%→90%→95%I→95%Ⅱ→100%I→100%Ⅱ酒精→二甲苯I→二甲苯Ⅱ梯度脱水、透明、封固、贴标签过程。

1.2.7 观察 在镜下仔细观察所制成的皮肤组织切片，并拍照进行对比，尤其对对不同月龄的皮肤组织异同做详细记录。

1.2.8 成片 所取样品经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、HE染色等流程，最终制成实验所需的不同月龄獭兔皮肤组织切片。

3.1 獭兔毛囊发育特点

据调查獭兔毛囊发育在胚胎第19 天时, 头部、背部、臀部和体侧的某些部位都开始出现初级毛囊原基形态。初级毛囊原基形态呈现出一圆形细胞集结。第20天时, 各部位初级毛囊原基数目逐步开始增多, 到第24 天时, 初级毛囊开始向真皮生长，逐步形成一管状鞘囊样, 同一时刻次级毛囊原基出现。第26 天时,明显分化已在毛囊与毛根处出现, 有毛球和毛乳头雏形, 并且毛根处均成功长出皮肤形成毛干。

试验可知獭兔皮肤组织初级毛囊在2月龄至5月龄生长期间已完全的停止生长，次级毛囊数目却逐步增多, 向真皮方向一直持续生长,初级毛囊的直径细小。皮肤横切面明显看到毛囊成群簇伞面状态分布，周围环绕若干较细软密的次级毛囊( 图2、3 、4 )。

图2 2月龄背部皮肤纵切的组织40× 图3 5月龄背部皮肤横切的组织40×

图4 5月龄背部皮肤横切的组织100× 图5 5月龄背部皮肤纵切的组织40×

3.2 皮肤表皮层的组织结构

表皮层:皮板的最顶层存在模式。在制裘过程中,确保表皮的完整无损,可大大增加毛与表皮之间的结合力,因其对酸、碱、盐和有侵蚀性有害气体有较强的抵抗力,可保护动物躯体不受外界伤害。镜下观察,明显观察到表皮共4层，分别为角质层、透明层、粒层、生发层。

19 d胎龄时, 獭兔头部及其体表侧方表皮为单层立方上皮,背部和臀部表皮为双层立方上皮两者区别明显(图 5)。在2 d胎龄时, 全身所有表皮全部为复层扁平上皮 。24 d胎龄时,表皮初次出现粒层,此时同步出现出角化。26 d胎龄时, 表皮肉眼可见变厚,明显出现分化，共四层分别为基层、粒层、棘层及角化层。28 d胎龄时, 镜下可观察到表皮的粒层细胞内，嗜碱性颗粒明显增多粗大状, 角化层增厚。通过实验证明：2月龄、4月龄及5月龄时, 各部表皮全部出现不同程度的厚度增加, 但结构特征未出现无明显的变化。

图6 5月龄背部皮肤纵切的毛囊100×

3.3 皮肤真皮层的组织结构

真皮层位于表皮和皮下组织之间一层,排列最紧密并且厚实。这一层实质为非常致密的结缔组织,是制裘的物质基础。真皮层含有两层即网状层和乳头层，观察得知真皮乳头层是由平行排列的胶原纤维束组成的，属于极其发达的皮层。资料显示，19天胎龄,真皮是原始间充质细胞,眼观为星状且相互间隙大 。2天胎龄时,部分梭形细胞由之前的星状间充质细胞演变而生，细胞间零星出现纤细胶原纤维。24天胎龄时,纤细胶原纤维不断持续变多,此时梭形细胞排列分散。26天胎龄, 真皮分化进度迅速可看到深层网状层和浅层乳头层 。28天胎龄,乳头层分化尤为突出,此刻胶原纤维大量出现,而真皮结缔组织中细胞成分较前者对比数量逐步下降 。通过实验显示，出生后的2月至5月龄(图 6),真皮网状层可达到最大厚度,胶原纤维束的排列显得更加密集厚实,且呈现出典型不规则致密结缔组织样。

长久以来在部分地区，人们在饲养皮用兔或者是肉兔时，通常容易忽视应充分结合兔的最佳采皮月龄，来出售商品兔从而提高兔的综合价值。特别是对于肉兔若在3～4月龄进行屠宰，兔皮张还未成熟，皮板较薄且张幅小，导致等级不高，加工利用率极低，从而造成经济价值大打折扣。通常獭兔自出生开始，第6周首先进行第1次换毛，时间可持续70 d左右。约在4月龄时开始进行第2次换毛，此阶段掉毛现象尤为严重，獭兔整个身体呈现被毛稀疏状，表面参差不齐，在臀部和躯体侧面特别明显，此过程持续约60 d。在5月龄左右时，此时兔毛正式进入成熟期发育，毛根最大特点是粗壮不容易脱落。此时皮板基本已成熟，柔韧性和弹性都处在最佳，皮板面积均达到等级标准，此阶段可作为采皮最佳月龄期。

因此，结合獭兔在不同生长时期的生理换毛规律，同时综合考虑兔皮板的成熟度因素后，獭兔的最佳采皮月龄应在5～8月龄，此阶段所采的兔皮商品价值最高，可有效提高养兔业者的经济效益。

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