铜纳米团簇的制备及其荧光性能研究进展

袁斌霞，孙永军，李 敏，秦德昭，王道累，刘建峰，曹 盛

(1.上海电力大学能源与机械工程学院，上海 200090)(2.广西大学 广西有色金属及特色材料加工重点实验室，广西 南宁530004)

随着测量与表征技术的进步，纳米科学和技术已经成为一个高度跨学科的新兴研究领域。自20世纪70年代以来，关于金属纳米颗粒(metallic nanoparticles, MNPs)的研究取得了丰富的成果。近几年，研究人员发现当MNPs的尺寸接近电子的费米波长时，其粒子特性消失，谱带变成离散能级[1]，表现出独特的光学性质；
这些尺寸介于原子与纳米粒子之间的超小粒子被称为金属纳米团簇(metal nanoclusters, MNCs)[2]。相较于量子点与有机染料等荧光材料，MNCs具有出色的光稳定性、大的斯托克斯位移及低毒性，可以补充甚至取代传统的荧光探针，为荧光检测和生物标记技术的发展提供了巨大的机会。

在过去的10余年中，MNCs的相关研究发展迅速，研究人员制备了多种新型荧光MNCs，使用的材料主要集中在Au及Ag，而非常有前途的铜纳米团簇(Cu NCs)受到的关注较少。与贵金属纳米团簇需要昂贵的前驱体相比，制备Cu NCs的前驱体资源相对丰富且价格低廉。首先，本文将介绍Cu NCs的合成方法及性质，然后详细介绍Cu NCs的光学性能，主要阐述在蛋白质、核酸、小分子、重金属离子、有机污染物、pH的检测及细胞成像中的应用研究，并展望Cu NCs未来的研究方向。

Cu NCs因其低成本、低毒性、良好的生物相容性和优异的荧光性而备受关注，但由于Cu NCs比表面积大，易发生团聚，并且在空气中表面易氧化，从而导致Cu NCs易变质。越来越多的研究者致力于制备稳定性强的Cu NCs，常用的Cu NCs制备方法主要是使用Cu2+通过还原剂和模板在特定环境下还原。

2.1 模板法

2.1.1 以脱氧核糖核酸(DNA)为模板合成铜纳米团簇

脱氧核糖核酸(DNA)具有纳米级的结构，无毒、生物相容性好、特异性识别分子能力强并且官能团丰富，广泛应用于纳米团簇的合成模板。2010年，Alexandru等[3]首次使用双链DNA(dsDNA)作为模板合成了Cu NCs(图1)，当采用340 nm激光激发后，所制备的Cu NCs在587～600 nm展现出优异的荧光性能，且荧光强度与dsDNA模板上的碱基对数有关。Qing等研究发现[4]，含有胸腺嘧啶的DNA(ssDNA)也可以作为合成Cu NCs的模板，制得的Cu NCs表现出良好的荧光特性。此外，DNA/RNA(核糖核酸)嵌合体也可以作为合成Cu NCs的模板，且与以DNA为模板制备的Cu NCs具有相同的光谱特性[5]。

图1 双链DNA(dsDNA)(a, b)与含有胸腺嘧啶的DNA(ssDNA)(c) 模板合成Cu NCs示意图[3]Fig.1 Schematic diagram of synthesis of Cu NCs by dsDNA (a, b) and ssDNA (c)[3]

2.1.2 以蛋白质为模板合成铜纳米团簇

蛋白质是一种天然模板，可以用于合成不同功能的纳米团簇，蛋白质上的胺基、羧基和硫醇基等基团不仅可以充当有效的还原剂，还可以作为模板和配体控制Cu NCs结构，提高其稳定性。2009年，牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)首次被报道用于金纳米团簇的合成[6]，之后研究人员以BSA为模板对银纳米团簇进行了研究。2011年，Goswami等[7]使用BSA为模板合成了水溶性Cu NCs，所制备的团簇由Cu5和Cu13组成，且具有蓝色荧光。2015年，Miao等[8]等以木瓜蛋白酶作为模板制备了Cu NCs，可在620 nm处发射红色荧光。2015年，Qiao等报道，鸡蛋白(chicken egg white, CEW)可作为模板快速合成绿色荧光的CEW@Cu NCs，并且荧光强度在pH为6.14～12.08范围内呈线性增长关系[9]。除上述研究以外，越来越多的蛋白质被用于合成Cu NCs，如溶菌酶、胰蛋白酶及酵母提取物等[10-12]。

2.1.3 以聚合物为模板合成铜纳米团簇

聚合物上的官能团可以作为Cu2+结合位点，因此聚合物可以直接用作合成Cu NCs的模板。Crooks研究组[13]以聚酰胺-胺型(polyamidoamine, PAMAM)树枝状大分子为模板和稳定剂合成了Cu NCs。聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)含有大量的氨基官能团，具有较强的Cu2+络合能力。同时，在还原剂(抗坏血酸、水合肼、甲醛等)的作用下，PEI-Cu2+前驱体在加热等条件下获得PEI-Cu NCs。Song研究组[14]以PEI为模板和保护剂、油酸(oleic acid, OA)为还原剂，用甲醛刻蚀合成了PEI-Cu NCs(图2)；
当反应温度分别为20，50，90和150 ℃时，PEI-Cu NCs发射波长逐渐由 460红移到600 nm，量子产率分别为8.2%，7.0%，5.3%和4.6%。Wang等[15]以聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVP)作为模板、抗坏血酸为还原剂，制备了蓝色荧光的Cu NCs(430 nm)，量子产率为8%；
进一步用谷胱甘肽(glutathione, GSH)处理后，量子产率增加到了27%。

图2 聚乙烯亚胺-Cu纳米团簇(PEI-Cu NCs)制备示意图[14]Fig.2 Preparation of polyethylenimine-Cu nanocrystals (PEI-Cu NCs)[14]

2.1.4 以小分子为模板合成铜纳米团簇

随着对Cu NCs研究的深入，研究者发现采用小分子修饰Cu NCs，会大大提高Cu NCs的量子产率和稳定性。目前，通常采用的模板主要包括巯基化合物和非巯基化合物。巯基化合物，如GSH、半胱氨酸和硫辛酸，它们都具有巯基官能团，该官能团既对Cu2+具有较强的络合能力，又具有较强还原性，可以直接将Cu2+还原，形成荧光Cu NCs。Wang等[16]以GSH为还原剂和保护剂，直接在乙醇中合成Cu NCs，获得亮橘色的Cu NCs，量子产率达到48%，远高于已报道的其他Cu NCs。Lin等[17]以巯基苯甲酸(mercaptobenzoic acid，MBA)的3个同分异构体为模板合成荧光Cu NCs。其中，邻位巯基苯甲酸为模板合成的蓝色荧光的Cu NCs，量子产率达到13.2%。可见，采用不同异构体为模板时，形成Cu NCs的聚集状态不同，导致荧光性质差别很大。非巯基化合物主要是指含羧基或者氨基等的小分子。Wang等[18]以腺苷为模板，柠檬酸缓冲液为还原剂，制备了蓝色荧光的Cu NCs，发射峰位于417 nm。Cao等[19]以单宁酸(tannic acid, TA)为模板、抗坏血酸为还原剂，制备了蓝色荧光的Cu NCs，激发和发射峰值分别位于360和430 nm，量子产率为14%，通过单宁酸中羧酸官能团修饰Cu NCs表面，可以有效防止Cu NCs的团聚和氧化，提高Cu NCs的稳定性。

2.2 无模板法

微波辐射是一种被广泛应用的新型加工技术，具有环保和低能耗的优点。微波辐射可以实现快速均匀加热，为纳米材料的合成提供了均匀的形核和生长环境。Hideya等[20]将Cu2+与NaOH分散在乙二醇中，然后置于微波炉中并加以搅拌，合成了具有高稳定性的小尺寸Cu NCs(平均尺寸2 nm，图3)，在350 nm的激发波长激发后，在475 nm显示出蓝色荧光峰。且在碱性环境下，乙二醇可发生乙氧基化反应，生成产物可抑制Cu NCs的氧化，增加Cu NCs的稳定性。同时，电化学合成法是合成各种功能性纳米粒子的有效方法。与化学合成相比，电化学合成法可以通过调节电流密度很容易地实现粒径控制。Huseyinova等[21]在没有任何表面活性剂的情况下，通过电化学方法，在水溶剂中合成了粒径小、单分散性高的Cu NCs，每个团簇由5个铜原子组成，该Cu NCs激发波长224 nm，发射波长为305 nm。该方法为更小尺寸Cu NCs的合成提供了参考。

图3 微波法制备Cu NCs示意图[20]Fig.3 Schematic diagram of preparation of Cu NCs by microwave method[20]

Cu NCs的荧光一般来自占据的d轨道和费米能级附近能级态之间的电子跃迁，或者最高占据分子轨道(highest occupied molecular orbital，HOMO)和最低未占据分子轨道(lowest unoccupied molecular orbital，LUMO)之间的电子跃迁。Cu NCs的荧光性质与许多因素有关，如尺寸、模板及有机溶剂等。

3.1 尺寸影响

Cu NCs的尺寸对其荧光强度以及发射波长都有非常大的影响。Wang等[22]通过界面刻蚀法制备了荧光Cu NCs，由于量子尺寸效应，当Cu NCs的平均尺寸从1.8增加到3.5 nm时，荧光峰从470红移到600 nm。Han等[23]通过氨基噻吩合成了Cu NCs，并发现在溶剂pH=3～7范围内，通过调整溶剂pH值，可以促进团簇间氢键的相互作用，形成络合作用，增加荧光强度。

3.2 模板影响

模板不仅可以作为Cu NCs的稳定剂，还可以对Cu NCs的荧光性质产生影响[24]。Zhang等[25]以不同对位取代基(4—F、4—Cl、4—Br、4—CH3、4—OCH3)的苯硫酚为模板合成Cu NCs，得到的不同取代基的苯硫酚修饰的Cu NCs具有不同的发射波长，并且随着取代基团的供电子性增加，发射波长位置逐渐从548红移至698 nm。表1列出了不同模板制备的Cu NCs的波长以及量子产率(quantum yield，QY)。

表1 已报道的具有不同模板的Cu NCs

3.3 溶剂影响

Yuan等[35]以GSH为模板制备了Cu NCs，研究了GSH-Cu NCs在6种有机溶剂(甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜)中的溶剂效应。加入不同的有机溶剂后，GSH-Cu NCs溶液在强光下呈乳白色；
在365 nm的紫外灯激发下，荧光发射波长从黄色到紫色变化，荧光强度的顺序为：N,N-二甲基甲酰胺>甲醇>二甲基亚砜>乙醇>异丙醇>正丙醇。当溶剂由非极性异丙醇转变为高极性二甲基亚砜时，发射峰最大值也发生了变化；
并且GSH-Cu NCs在乙醇溶剂中稳定性最好(图4)。

图4 不同溶剂合成Cu NCs的荧光特性表征[35]：(a)强光下的溶液颜色，(b)365 nm紫外灯下的溶液颜色，(c)荧光强度，(d)稳定性测试Fig.4 Characterization of Cu NCs synthesized by different solvents[35]: (a) color of solution under strong light, (b) color of solution under 365 nm UV lamp, (c) fluorescence intensity, (d) stability test

由于Cu NCs生物相容性好、化学稳定性良好、荧光特性优异、斯托克位移大，从而能够提高检测信号，因此在生物标记及荧光成像方面得到了应用。

4.1 蛋白质检测

蛋白质具有丰富的官能团，为使用Cu NCs对其检测提供了可能。由于Al3+与焦磷酸(pyrophosphoric acid, PPi)的强配位作用，焦磷酸加入到Al3+溶液中会增强Cu NCs荧光。Ye等[36]研究了无机焦磷酸酶(pyrophosphatase，PPase)的检测方法：当加入PPi后，由于PPi和Al3+之间的亲和力更强，降低了Cu NCs荧光强度；
而加入PPase可使PPi被水解成两分子正磷酸盐(Pi)，荧光强度恢复，从而实现对PPase的检测，检测极限为1.3 μm·mL-1。Hu等[37]发现聚苯乙烯磺酸(poly(styrenesulfonate)，PSS)可以提高Cu NCs的稳定性，而细胞色素c(cytochrome，Cyt c)能猝灭PSS-Cu NCs的荧光。同时，加入胰蛋白酶导致Cyt c水解成小肽片段，会使PSS-Cu NCs恢复荧光；
因此，通过该方法可实现对Cyt c和胰蛋白酶的检测(如图5)。除此之外，Cu NCs还可以对糖蛋白、核酸酶及半乳糖苷酶等蛋白质进行检测[38-40]。

图5 Cu NCs对Cyt c和胰蛋白酶检测示意图[37]Fig.5 Schematic diagram of Cyt c and trypsin detection by Cu NCs[37]

4.2 核酸检测

由于不同单链DNA之间可通过碱基对形成双链DNA，可作为模板剂合成Cu NCs，这为DNA的检测提供了新方法。Chen等[41]构建了一种用于人类嗜T细胞病毒(human T-cell lymphotropic virus，HTLV-I)型DNA的荧光生物传感器。在HTLV-I DNA的存在下，核酸酶Ⅲ(exoⅢ)可以从DNA中释放出大量富含腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对(adenine-thymine, AT)的ssDNA (o-DNA)，释放出的o-DNA与修饰石墨烯量子点(graphene quantum dots，GQDs)表面的DNA杂交，其最低检测限为10 pL·L-1(检测过程见图6)。微小核糖核酸(microRNA, miRNA)表达水平的变化可以作为诊断不同癌症的生物标志物，通过3′末端磷酸化的DNA与miRNA杂交反应形成可被双链特异性核酸酶(double-stranded specific nucleases, DSN)消化的DNA/RNA异源双链，与miRNA互补的DNA片段被DSN水解释放出带有含3′-OH的DNA，并在末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)的辅助下形成poly T，可作为生成高荧光的Cu NCs的配体，进而实现对miRNA的检测[42]。因此，通过不同DNA为模板合成的Cu NCs与多元化学计量学分析相结合，可以检测不同的核酸[43]。

图6 以HTLV-I型DNA为模板合成Cu NCs及定量检测DNA的示意图[41]Fig.6 Schematic diagram of synthesis of Cu NCs and quantitative detection of DNA using HTLV-I DNA as template[41]

4.3 小分子检测

特殊小分子可以通过表面官能团与Cu NCs相互作用，促使Cu NCs结构发生变化，从而产生荧光猝灭，利用此性质可以对特殊小分子进行检测。半胱氨酸(Cys)被认为是一种神经毒素，Cys水平不足或过多会导致各种疾病。Rajamanikandan等[44]发现GSH-Cu NCs表面可与Cys的巯基之间发生金属-硫醇相互作用，从而引起GSH-Cu NCs的猝灭，该方法中Cys最低检测限为8.63×10-9mol·L-1。过氧化氢(H2O2)是一种重要的生物小分子，参与细胞信号转导、衰老和癌症等多种生理过程。Ling等[45]以PEI为模板合成了Cu NCs，构建成荧光纳米探针用于检测H2O2，最低检测极限为0.5 μmol·L-1。除此之外，以PEI为模板合成的Cu NCs也可以实现对H2O2的检测[34]。Shao等[46]发现诺氟沙星(norfloxacin，NOR)可通过内滤效应及团聚诱导使以L-蛋氨酸为模板合成的Cu NCs发生荧光猝灭，实现对NOR的快速检测，检测下限为17 nmol·L-1。另外，Cu NCs对曲酸及鸟苷5′-三磷酸同样具有检测效果[47, 48]。

4.4 细胞成像

Cu NCs由于具有合成简单、发射波长可调、分散性好、生物相容性好及毒性低等优点，在生物成像领域引起了广泛关注[49]。与其它成像方法相比，荧光成像在灵敏度、检测能力和设备成本方面具有独特的优势[50]。Rajamanikandan等[44]利用GSH修饰的铜纳米团簇(GSH-Cu NCs)作为荧光探针时，遇到活细胞中的Cys会发出亮红色荧光，从而实现了对白血病细胞的成像。Wang等[51]以牛血清蛋白为模板合成了BSA-Cu NCs，可对人口腔癌细胞(oral cancer cells，CAL-27)进行细胞成像。Ramadurai等[52]报道了以3-巯基丙基磺酸盐(3-mercaptopropyl sulfonate, MPS)为模板的新型Cu NCs，使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)滤波器(460～490 nm)产生绿色荧光，对A549肺癌细胞进行了有效成像。可见，Cu NCs在生物医学和癌症诊断应用中的具有适用性。

随着经济社会的发展，环境污染日趋严重，环境恶化不仅会影响人们正常生活，甚至会影响人们的身体健康，实时监控环境污染物是环境保护和疾病预防的先决条件。Cu NCs由于其特殊性质，可用于离子、有机污染物及pH值的检测。

5.1 离子检测

Cu NCs与离子之间会引起静电或范德华力，进而对其荧光产生影响[53]。Hg2+、Fe3+及Pb2+等重金属离子是一种剧毒污染物，会对人的大脑、神经系统和肾脏等造成重大伤害[54]。Benavides等[55]利用多硫醇聚合物生成Cu NCs，Hg2+可诱导该Cu NCs发生聚集引起荧光猝灭，进而实现对Hg2+的检测，该方法已应用于人类尿液检测。当尿液中Hg2+在10～100 μmol·L-1的范围内时，会引起Cu NCs荧光呈线性猝灭。Wang等[56]通过超声化学法，以GSH为还原剂制备了GSH-Cu NCs。GSH-Cu NCs中有游离的羧基和氨基，Pb2+可与之结合从而使GSH-Cu NCs产生荧光猝灭，Pb2+检测的最低极限为1 nmol·L-1。Das等[57]利用GSH作为模板和还原剂合成发蓝光的GSH-Cu NCs，Fe3+离子与GSH-Cu NCs表面电子发生相互作用从而引起GSH-Cu NCs荧光猝灭，Fe3+检测的最低极限为25 nmol·L-1。

图7 Cu NCs检测S2-的示意图[58]Fig.7 Schematic diagram of Cu NCs testing S2-[58]

5.2 pH检测

酸碱度(pH值)在环境和生物医学研究中具有非常重要的作用，会引起酸雨以及微生物种群的增长[60]。在不同pH值条件下，用于合成Cu NCs的蛋白质结构以及性质都会发生变化。Pandit等[61]使用溶菌酶作为模板合成了Cu NCs，当pH值在2.50～7.50范围时，Cu NCs的荧光发射强度和平均衰减时间随着溶液pH值的降低而逐渐增加。这是由于随着pH值的变化，溶菌酶结构发生变化，从而导致了Cu NCs的表面结构变化。Miao等[62]发现BSA在碱性环境中带负电，因静电排斥作用可阻止BSA-Cu NCs聚集；
当pH值下降时，正负电荷中和，导致BSA-Cu NCs在静电吸引作用下聚集，使BSA-Cu NCs发生荧光猝灭。当pH值从12变到5时，该团簇荧光强度线性降低，可用于检测较宽范围的酸碱度。

5.3 有机物污染物检测

Cu NCs在有机污染物的检测方面也有着广泛的应用。2015年，Zhang等[63]提出了一种检测微囊藻素-亮氨酸-精氨酸(micro cystin leucine arginine，MC-LR)的检测策略，利用dsDNA-Cu NCs的出色荧光特性，以及它与MC-LR和其适体链的特异性识别功能，因而对MC-LR具有高灵敏度和高选择性(检测过程见图8)。Wang等[64]以腺苷为模板合成了Cu NCs，可用于检测呋喃妥因(nitrofurantoin，NFT)，具有高灵敏度和高选择性，可应用于对水体污染物的检测。Deng等[65]以BSA为模板合成了Cu NCs，并对2,4,6-三硝基苯酚(2,4,6-trinitrophenol, TNP)进行了荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer，FRET)检测；
基于Cu NCs的荧光光谱和TNP在350至450 nm的吸收光谱之间的光谱重叠，首次开发了Cu NCs和TNP的能量供受体对的估算；
在TNP存在下，Cu NCs的荧光急剧猝灭，该方法对TNP最低检测极限为120 nmol·L-1。除此之外，Cu NCs还可用于赭曲霉毒素A及三聚氰胺的检测[66, 67]。

图8 dsDNA-Cu NCs对微囊藻素-亮氨酸-精氨酸(MC-LR)检测示意图[63]Fig.8 Schematic diagram of MC-LR detection by dsDNA Cu NCs[63]

5.4 温度检测

温度升高会导致Cu NCs间热碰撞频率和非辐射跃迁增加，同时也会使其辐射跃迁和荧光发射强度降低，基于此可实现Cu NCs对温度的检测。Fu等[68]通过Cu NCs与层状双金属氢氧化物(layered double hydroxide，LDH)合成了高量子产率的Cu NCs/LDHs薄膜材料；
当温度为10～60 ℃时，该材料的荧光强度具有良好的温度响应特性，并具有良好的循环特性。Ye等[69]以GSH为模板合成了Cu NCs，在生理温度范围内(20～45 ℃)，在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中具有良好的热响应特性，这项研究为Cu NCs在临床诊断相关生物医学的应用提供了可能。

在过去的几十年里，关于铜纳米团簇(Cu NCs)化学合成的研究已取得了重大进展，使其光学性能可与金纳米团簇(Au NCs)及银纳米团簇(Ag NCs)相匹配。虽然已合成了各种结构的Cu NCs，但其合成机理的研究仍有不足，在高反应速率下，粒径及组分的精确控制仍有困难，其稳定性和发射波长仍不能得到精确控制。Cu NCs的应用目前仅局限于荧光检测方面，研究表明Cu NCs在催化领域也具有很大的应用潜力。因此，关于Cu NCs的研究工作仍有很大的改进空间，主要可以从以下几点出发：

(1)目前合成的Cu NCs尺寸分布不均、稳定性不高，并且Cu NCs的发射波长只能通过产物测试得到，无法预测。因此，需要继续探索Cu NCs的合成机理和荧光发射机理，探索出一种高效、可控的反应路线来制备组分及尺寸可控的Cu NCs，并实现其荧光发射波长的预测。

(2)Cu NCs量子产率相对较低，且Cu NCs发射波长在可见光范围内，从而限制了其在生物成像中的应用。因此，如何制备出量子产率高、发射波长在可见～红外范围内可调的Cu NCs，仍有很大的研究空间。

(3)Cu NCs对污染物的检测精确度容易受到探针浓度、外部环境及仪器条件变化(如光漂白、散射光等)的影响。因此，提高Cu NCs的稳定性及优化检测物选择性，或开发新型检测响应模式的检测方法具有重要意义；
另外，开发具有污染物检测和去除双重功能的Cu NCs具有重要研究价值[70]。

(4)目前，关于Cu NCs在催化方面的研究报道较少。金属尺寸越小，其催化活性越高，且原子数n≤8的Cu NCs具有较高的氧还原催化特性[71]。同时，Cu NCs具有较高的比表面积与体积比，这也有利于提升其催化性能；
但目前Cu NCs在催化领域的应用未得到足够的重视，关于Cu NCs催化性能的研究仍有很大的空间。

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