miRNA,在动脉粥样硬化中调控血管平滑肌细胞的研究进展

冯 登，程 鹏，王 毅，郑江华

(1.川北医学院临床医学系，四川 南充 637000；
2.川北医学院附属医院血管外科，四川 南充 637000)

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种以动脉壁炎症介质和免疫激活为特征的慢性免疫炎症性疾病，由不同趋化因子与各种血管细胞和非血管细胞相互作用导致AS 病变[1]。这些细胞包括血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）、巨噬细胞（macrophage，Mø）、内皮细胞（endothelial cells，ECs）等。AS 中VSMCs 作为血管的重要组成部分，其涉及的生理病理过程，包括细胞增殖、迁移、自噬、凋亡、钙化、衰老和表型转换等，影响AS 的形成及发展。在转录水平或转录后水平调控AS 相关基因的表达，有助于缓解AS 的进展。因此，了解miRNA 在AS 发生和发展中调控VSMCs 的作用机制至关重要。本文对miRNA 进行概述，并对miRNA 在VSMCs 功能调节中的作用及其临床应用作一综述，以期为AS 相关疾病的预防及治疗提供思路。

miRNA 是一类大约含有22 个核苷酸的非编码单链RNA，其前体具有发夹或折叠的二级结构，负责转录后基因调控[2]。因miRNA 与靶基因具有互补性，miRNA 可以通过互补配对结合到基因的mRNA的3′UTR，从而抑制该基因翻译。此外，miRNA 也可以通过靶向mRNA 的5′UTR 和CDS 区来调节靶基因的表达[3]。植物中miRNA 与靶基因几乎以完全互补配对的方式结合，然而动物中的miRNA 和靶mRNA 并不完全互补，但是靶点至少有7 个碱基与miRNA 5′端互补，才能调控其靶基因[4]。当两者完全互补时，可以导致靶mRNA 降解。不完全互补时，miRNA 则主要通过与靶mRNA 的3′UTR 结合，阻遏转录后翻译。据估计[5]，miRNA 调节大约1/3 的蛋白质编码基因的表达，它们既被视为表观遗传学变化（如DNA 甲基化）的靶点，也被视为表观遗传学修饰因子（如DNA 甲基转移酶）的调节器。通常一个miRNA 可以调控多个基因的表达，几个miRNA 的组合也可以用来精细调控某个基因的表达，从而构成体内复杂的miRNA 调控网络。虽然miRNA 已知在AS 中表达，但其在与AS 相关疾病中的作用尚未完全明确。因此，深入针对miRNA 的研究有助于开发更准确的诊断和预后循环生物标志物，以及提供针对不同阶段AS 的治疗策略。

2.1 miRNA 调控VSMCs 增殖与迁移 VSMCs 主要分布在动脉的中层，通过一层弹力板与内膜隔开，但也有少量平滑肌细胞分布在内膜。AS 病变部位的VSMCs 主要是从中膜迁移而来。VSMCs 的增殖和迁移既是机体对损伤的修复反应，也是AS 发生发展的主要病理基础。Li ML 等[6]研究发现，miR-362-3p的上调通过抑制血小板反应蛋白解整合素金属肽酶1（a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin motif-1，ADAMTS1）的表达，抑制了VSMCs 的增殖和迁移。胰岛素样生长因子（insulinlike growth factors 2，IGF-2）是一种具有复杂调节模式的生长因子，其活性部分受差异表达的IGF-2 受体和IGF 结合蛋白的调节，miR-637 通过下调IGF-2抑制VSMCs 的增殖和迁移，从而影响AS 的进展[7]。神经纤毛蛋白-2（neuropilin 2，NRP2）是一种非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，miR-377-3p 通过靶向NRP2 抑制AS 模型中VSMCs 的增殖和迁移[8]。Ghasempour G 等[9]研究表明，miR-181b 和miR-204 通过趋化因子（chemokine）信号通路下调造血细胞激酶（hematopoietic cell kinase，HCK），进而抑制了VSMCs的增殖和迁移。miR-125a 通过靶向HMG-CoA 还原酶（HMGCR）调节甲羟戊酸（mevalonate）信号通路抑制VSMCs 增殖和迁移[10]。此外，还有一些miRNA 可促进VSMCs 的增殖和迁移。miR-93 首次被证明能靶向线粒体融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）促进VSMCs 增殖和迁移，其调控过程是通过抑制Raf-ERK1/2 信号通路实现的[11]。miR-378a-5p 是通过靶向CDK1/p21 信号通路促进VSMCs 增殖和迁移的关键介质[12]。Kruppel 样因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4）是一种锌指蛋白转录因子，microRNA-92a 通过抑制其表达，从而调控ROCK/MLCK 信号通路促进VSMCs 增殖和迁移[13]。miR-320a 通过靶向抑制G 蛋白调节信号蛋白5（RGS5）促进VSMCs 增殖和迁移，从而加重AS[14]。Kang XL 等[15]研究发现，miR-3646 通过靶向RHOH 促进VSMCs 的增殖和迁移。Sun B 等研究证明[16]，miR-186-5p 的上调促进VSMCs增殖和迁移，还发现AS 患者血清miR-186-5p 水平与颈动脉内膜中层厚度（CIMT）呈正相关。因此，它可能是AS 的诊断生物标志物。

2.2 miRNA 调控VSMCs 表型转化 在正常生理情况下，VSMCs 保持静止状态，通过维持血管壁张力和完整性在血管内环境稳定中发挥着重要作用。在细胞外刺激或环境影响下，VSMCs 表现出表型可塑性，即可以从收缩/非增殖表型转换为迁移/增殖表型。VSMCs 的表型可塑性是由特定标记物的表达来定义的，如平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、转胶蛋白和钙调蛋白等[17]。Farina FM 等[18]研究报道，miR-128-3p 是一种新的表型开关调节器，能调控VSMCs 的迁移、增殖、分化和收缩性，而KLF4 是miR-128-3p 的直接靶点，能够调节关键VSMCs基因肌球蛋白重链11（MYH11）的甲基化状态。Yan SR 等[19]研究证实，在AS 中miR-338-3p 表达升高，而升高的miR-338-3p 抑制结蛋白的表达，从而促进收缩型VSMCs 向合成型VSMCs 的表型转变。除了形态学改变外，miR-338-3p 还增强了VSMCs 的增殖能力，但不增强其移动能力。总之，miR-338-3p 促进了AS 的发展。miR-17-5p 通过下调同源盒基因B13（HOXB13）抑制血小板衍生因子（PDGF-BB）刺激的表型调节VSMCs，表明这些因素可能是内膜增生的潜在治疗靶点[20]。miR-33a 介导磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt/mTOR）通路促进VSMCs 表型转化,加速AS 的发生和发展[21]。Zhuang XJ 等[22]实验证明，miR-146b-3p通过靶向磷脂酰肌醇-3 激酶催化亚基γ（PIK3CG）抑制PDGF-BB 诱导的VSMCs 表型转换。miR-145靶向VSMCs 上表达的趋化因子C-C-基元受体2（CCR2），促进收缩性VSMCs 表型，并减少AS 中的不稳定斑块[23]。miR-4463 通过靶向碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）直接或间接激活c-jun 氨基末端激酶（JNK）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路，最终促进VSMCs 表型转换[24]。

2.3 miRNA 调控VSMCs 凋亡与自噬 细胞程序性死亡包括凋亡及自噬，是不同于细胞坏死的一种死亡方式,是由生物本身基因决定的细胞主动而有序的死亡方式。VSMCs 凋亡是由促炎性细胞因子、氧化低密度脂蛋白、高水平一氧化氮和机械损伤诱导的，其特征在于VSMCs 细胞质残留物周围的基底层增厚。通常情况下，VSMCs 可以通过自噬来维持细胞自身结构和功能的稳定，但在被各种刺激过度激活后导致AS 的加速发展，如活性氧和脂质种类、细胞因子、生长因子和代谢应激[25]。Cui RR 等[26]研究发现，miR-494 通过下调BCL2 样蛋白11（BCL2L11）的表达抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的VSMCs凋亡。

ROBO4 是神经元Robo 家族的主要同系物，之前被认为是一种关键的血管特异性受体，在血管内皮中特异表达并抑制ECs 迁移。miR-140-5p 通过靶向抑制AS 中的血管内皮调节蛋白（ROBO4）基因表达从而抑制VSMCs 凋亡[27]。TGFBR1 是一种膜结合蛋白，属于TGFBR 亚家族，MiR-665 通过靶向转化生长因子β 受体1（TGFBR1）促进VSMCs 的凋亡[28]。Bao Q 等[29]研究发现，miR-210 靶向抑制VSMCs 中的肌细胞增强因子2C（MEF2C）来抑制凋亡。miR-4787-5p 通过靶向蛋白激酶D1（PKD1）和抑制PI3K/Akt/FKHR 通路促进VSMCs 凋亡[30]。Wang WR 等[31]研究显示，抑制miR-145 表达促进了转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激的VSMCs 的自噬。植物源性Sal-miR-58 通过调节Krüppel 样因子3/E3 泛素连接酶/磷酸果糖激酶（KLF3/NEDD4L/PFKP）途径促进VSMCs 自噬并减轻炎症[32]。Liang X等[33]研究发现，miR-4487 通过靶向抑制RASA1 进而抑制VSMCs 凋亡。

2.4 miRNA 调控VSMCs 衰老 AS 是一种衰老疾病，其发病率和患病率随年龄增长而增加。衰老见于构成AS 斑块的所有细胞，尤其是VSMCs，可促进AS及其斑块的不稳定。衰老的标志包括细胞衰老、DNA 损伤（包括端粒磨损）、线粒体功能障碍、促炎性分泌表型、蛋白质稳定缺陷、表观遗传变化、营养传感失调和祖细胞衰竭[34]。Chen YL 等[35]研究结果表明，miR-214 通过靶向RNA 结合蛋白（quaking）从而促进VSMCs 衰老，其机制可能与端粒完整性受损和VSMCs 细胞周期停滞有关，这意味着miR-214可能是血管衰老的标志物和血管疾病的潜在治疗靶点。SDC1 是硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族的关键成员之一，miR-665 抑制通过负向调节多配体蛋白聚糖-1（SDC1）发挥VSMCs 衰老的重要调节作用，此外，miR-665 通过与lncRNA GAS5 相互作用调节VSMCs 衰老[36]。自噬相关蛋白（Beclin1）是一种与自噬密切相关的因子，当自噬发生时，它会显著上调，Tan P 等[37]研究证实，miR-30a 直接下调Beclin1 促进VSMCs 的衰老。

2.5 miRNA 调控VSMCs 钙化 钙化是羟基磷灰石矿物质在动脉壁的沉积，发生在动脉内膜和中层。内膜钙化与动脉闭塞和AS 斑块破裂有关，其主要驱动因素是炎症、氧化应激、细胞凋亡和中层钙化。虽然最初被认为是一个被动过程，但内膜和中层的钙化是一个主动且受严格调控的过程，主要由VSMCs驱动[38]。He L 等[39]研究结果表明，在高磷诱导的血管钙化过程中，miR-103a 通过抑制成骨特异性转录因子（Runx2）减轻血管钙化，这是治疗这种病理现象的潜在新靶点。miR-223-3p 通过阻断白细胞介素-6/信号传导蛋白和转录激活物3（IL-6/STAT3）信号抑制血管钙化[40]。miR32-5p 通过靶向含FYVE 指磷酸肌醇激酶（PIKfyve）上调微环境中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α），促进VSMCs 钙化[41]。在高钙/高磷条件下，miR155 通过抑制雷帕霉素靶蛋白复合物2（Rictor/mTORC2）抑制Akt 的激活，导致叉头框蛋白O 亚族3a（FOXO3a）磷酸化和降解降低，FOXO3a 在细胞核内的积累激活了促凋亡蛋白（如Bim）的转录，从而增强VSMCs 凋亡。凋亡的VSMCs 随后促进血管钙化[42]。组蛋白去乙酰化酶5（HDAC5）是Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的成员，miR-134-5p通过抑制VSMCs 中的HDAC5 诱导钙化[43]。Zhang F等[44]研究表明，miR-140-5p 通过靶向Toll 样受体（TLR4）抑制β-甘油磷酸诱导的VSMCs 钙化，为血管钙化提供了一种潜在的治疗方法。

miRNA 是一系列疾病状态中潜在的诊断或预后标志物。因为循环中的miRNA 可以在外周血、唾液和尿液中检测到，其表达可能是AS 疾病各个阶段的先兆。将多个miRNA 组合在一个miRNA 图谱中可能比单个microRNA 图谱的评估更准确。因此，为了确定miRNA 作为AS 相关疾病生物标记物的作用，开展大规模研究至关重要。脂质体、聚合物胶束和基于脂蛋白的药物载体等药物递送载体正在开发中，以将这些寡核苷酸递送至细胞。Wang J 等[45]基于两亲性三嵌段共聚物（PCEC）材料，通过自愈封装工艺开发了一种miR-22 洗脱心血管支架，在最佳剂量下，miR-22 的持续释放在不干扰ECs 增殖和功能的情况下显著增强了VSMCs 的收缩表型并抑制其增殖，从而显著导致抑制支架内狭窄。Izuhara M 等[46]研究证实，含miR-126（纳米颗粒）NPs 通过抑制（胰岛素受体底物1）IRS-1 减少VSMCs 的增殖和迁移，然后制备了含miR-126 复合（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）PLGA NPs 涂层裸金属支架，在兔再狭窄模型中，这种输送系统对新生内膜的形成有明显的抑制作用。

miRNA 可以通过靶基因及信号通路调控VSMCs 功能，从而促进或抑制AS。但由于miRNA 通常针对同一调控网络中的多个基因，了解特定miRNA靶点的完整性以及了解miRNA 途径中干扰因素至关重要。miRNA 靶向基因网络的能力不仅为通过调节基因通路治疗疾病提供了独特的方法，另一方面还可了解其他靶基因的潜在有害影响，因此如何避免潜在有害影响也是未来研究的关键问题。相信随着对VSMCs 功能调控的研究，针对AS 相关疾病的miRNA 靶向治疗具有广阔前景。

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