基于Wnt信号通路分析葛根素对大鼠颈动脉球囊损伤术再狭窄的干预作用

张 翀，李 丽，祁卫华，赵玉杰，张红霞

颈动脉球囊损伤术再狭窄主要指颈总动脉、颈内动脉等损伤后发生致命性喷射性出血，若不及时医治则导致死亡，伤口不大仅表现为侧壁损伤，短时间内发生颈部大血管压迫气管，导致呼吸困难，并形成假性动脉瘤；
若静脉同时发生损伤，则可能有瘘口相通形成动静脉瘘[1-3]。病人一旦发生颈动脉损伤后多数采用球囊损伤术治疗，但术后少数病人出现再狭窄症状[4]。有研究显示，注射葛根素可减轻临床症状，通过抑制Wnt表达，进而改善狭窄[5]。关于葛根素干预颈动脉球囊损伤术再狭窄的动物研究较少。本研究基于Wnt通路分析葛根素对颈动脉球囊损伤术再狭窄的干预作用。

1.1 实验动物 75只大鼠由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室提供[动物许可证号：SYXK(豫)2021-0003]，鼠龄3～5(3.80±0.95)个月，体质量225～263(231.80±18.05)g，将大鼠置于室温23～25 ℃，湿度40%～70%，自然光照、通风的无病原菌干净笼子中饲养，饮用水和食物均消毒。本研究经医院伦理委员会批准。

实验仪器与试剂：倒置相差显微镜(日本Olympas公司)；
二氨基联苯胺法(DAB)显示剂(迈新生物技术开发生物技术有限公司)；
酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒及相关试剂(北京索莱宝科技有限公司)；
葛根素(江苏天晟药业有限公司，国药准字H20044253)；
小鼠抗大鼠Wnt抗体(上海中乔新舟生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模 在75只大鼠中随机选取15只作为正常组，不进行任何处理；
其余大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，各15只。参照徐荣伟等[6]方法建立颈动脉球囊损伤术再狭窄大鼠模型。除正常组外，其余各组大鼠在喂养14 d后采用水合氯醛进行腹腔麻醉，分离颈外动脉，结扎远端，在近端做一切口，逆行插入球囊导管，注入生理盐水0.2 mL，反复拉3次，一旦发现颈动脉内膜损伤立即撤出导管，在动脉远端予以结扎。建模成功标准：大鼠表现为颈动脉损伤后再狭窄症状。

1.2.2 给药 在野葛中提取葛根素，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠均给予葛根素耳缘静脉注射5周，剂量分别为3 mg、60 mg、100 mg，模型组给予等体积生理盐水耳缘静脉注射。

1.2.3 病理组织学 大鼠禁食不禁水12 h，麻醉处死，迅速摘取颈动脉后立即固定在染色液中，将制备的大鼠颈动脉组织样本在甲醛溶液中固定24 h后，进行常规脱水、透明、石蜡包埋，制备厚度为4 μm的组织切片，取主动脉组织石蜡包埋切片，经苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片后，显微镜下观察、拍照分析，并测量大鼠新生内膜面积、管腔面积。

1.2.4 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、硫化氢(hepatic gas，H2S)、1型胶原(Collagen 1，Collagen1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotein-2，MMP-2)、Wnt1、Wnt3a水平测定 抽取各组大鼠空腹静脉血2 mL，离心半径5 cm，以3 000 r/min离心3 min，分离上层血清，在-42 ℃条件下保存备用。采用ELISA检测VEGF、TNF-α、H2S、Collagen1、MMP-2、Wnt1、Wnt3a水平，以1∶2稀释液稀释样品；
在反应孔中加入以稀释的标准品每孔100 μL，35 ℃恒温孵育箱中湿育2 h；
使用洗涤液将反应板清洗3次后，加入1∶100倍稀释后的抗体工作液每孔100 μL，置于35 ℃条件下中湿育45 min，在反应孔内加入TMB溶液每孔100 μL，置于35 ℃条件下45 min后在反应孔内加入终止液用于终止反应，在450 nm波长测定吸光度，绘制标准曲线计算VEGF、TNF-α、H2S、Collagen1、MMP-2、Wnt1、Wnt3a(颜色反应深浅与VEGF、TNF-α、H2S、Collagen1、MMP-2、Wnt1、Wnt3a成正比)。

1.2.5 Wnt信号通路相关蛋白表达 采用免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白表达量，实验步骤：将颈动脉组织接种于6孔板中，24 h贴壁后各组进行处理，使用二喹啉甲酸法(BCA)测定浓度，制备电泳样品，上样量50 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入脱脂奶粉封闭1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，洗膜每次5 min，共3次；
二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，洗膜每次5 min，共3次，取重叠值。采用软件分析蛋白条带灰度值，内参蛋白为GAPDH。

2.1 各组大鼠病理组织学改变 正常组大鼠血管结构完整，未发现脱落的内皮细胞，内膜光滑；
模型组大鼠弹力纤维缺损，出现大量断裂，管腔面积不规则；
药物干预后，低剂量组、中剂量组大鼠血管平滑肌细胞向内膜迁移，但排序相对规则；
高剂量组大鼠管腔面积规则，细胞结构完整。详见图1。

图1 各组大鼠病理组织学改变(HE，×400)

2.2 各组大鼠新生内膜面积、管腔面积比较 高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组新生内膜面积大于正常组，管腔面积小于正常组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组、低剂量组新生内膜面积小于模型组，管腔面积大于模型组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组新生内膜面积小于低剂量组，管腔面积大于低剂量组(P<0.05)；
高剂量组新生内膜面积小于中剂量组，管腔面积大于中剂量组(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠新生内膜面积、管腔面积比较(±s) 单位：mm2

2.3 各组大鼠VEGF、TNF-α、H2S比较 高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组VEGF、TNF-α水平均高于正常组，H2S均低于正常组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组、低剂量组VEGF、TNF-α水平低于模型组，H2S高于模型组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组VEGF、TNF-α水平低于低剂量组，H2S高于低剂量组(P<0.05)；
高剂量组VEGF、TNF-α水平低于中剂量组，H2S高于中剂量组(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠VEGF、TNF-α、H2S比较(±s)

2.4 各组大鼠Collagen1、MMP-2比较 高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组Collagen1、MMP-2水平均高于正常组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组、低剂量组Collagen1、MMP-2水平低于模型组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组Collagen1、MMP-2水平低于低剂量组(P<0.05)；
高剂量组Collagen1、MMP-2水平低于中剂量组(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠Collagen1、MMP-2比较(±s) 单位：%

2.5 各组大鼠Wnt通路蛋白表达比较 高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组Wnt1、Wnt3a蛋白表达水平均高于正常组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组、低剂量组Wnt1、Wnt3a蛋白表达水平低于模型组(P<0.05)；
高剂量组、中剂量组Wnt1、Wnt3a蛋白表达水平低于低剂量组(P<0.05)。详见表4、图2。

表4 各组大鼠Wnt通路蛋白表达比较(±s)

图2 各组大鼠Wnt通路蛋白表达条带图(A为正常组；
B为模型组；
C为低剂量组；
D为中剂量组；
E为高剂量组)

颈动脉分为内层、中层和外层，以内膜过度用力牵拉下撕裂的情况常见。一旦发生颈动脉损伤后，常采用颈动脉球囊损伤术进行治疗，但球囊损伤术可能造成颈动脉再狭窄的情况[7]。本研究探讨Wnt通路在葛根素对鼠颈动脉球囊损伤术再狭窄的干预作用，为临床治疗提供依据。

葛根素是从植物野葛中提取的一种药物，具有扩张冠状动脉、改善脑血管功能、活血化瘀的作用，显著改善冠状动脉循环，并达到降低血黏度的目的[8]。胡彦武等[9]研究显示，葛根素可降低心肌耗氧量。葛根素可降低钙调蛋白活性，增加细胞变性，抑制血小板聚集[10]。张腾飞等[11]研究显示，葛根素干预治疗支架内再狭窄，能减小病人再狭窄面积，抑制血管降解，从而抑制再狭窄形成。吕婧等[12]研究显示，葛根素可用于防治神经病理性疼痛，但关于其治疗的相关分子机制报道较少。目前关于葛根素在颈动脉球囊损伤术再狭窄中的应用研究较少。本研究结果显示，葛根素可减少颈动脉球囊损伤术再狭窄的发生情况，其原因可能与葛根素类成分可抑制血小板聚集，且生物利用度高，发挥改善颈动脉的作用有关。

颈动脉球囊损伤术再狭窄的主要机制为血管平滑肌细胞增殖及迁移所致的内膜过度增生，局部血栓形成，细胞外基质形成及晚期血管负性重塑球囊损伤血管内皮后导致再狭窄发生[3，13-14]。余惠珍等[15]研究显示，MMP-2是水解变性胶原及基膜的主要有效成分，通过损伤的平滑肌细胞大量分泌，颈动脉球囊损伤术再狭窄MMP-2表达水平异常。本研究结果显示，MMP-2在颈动脉球囊损伤术再狭窄模型大鼠中呈低表达，证实了MMP-2可作为有效的检测指标。有研究证实，Collagen1在各组织中发挥着重要的支持作用[16]。有研究指出，Collagen1参与细胞增生修复、组织损伤、生长分化、炎症反应等过程[17]。本研究结果显示，葛根素能改善血管损伤，降低MMP-2、Collagen1水平，提示葛根素能抑制大鼠球囊损伤部位的再狭窄。同时本研究结果显示，使用葛根素治疗后大鼠MMP-2、Collagen1、VEGF、TNF-α水平降低，H2S水平升高，此类药物具有改善冠状动脉循环、降低血黏度的作用。说明MMP-2、Collagen1、VEGF、TNF-α、H2S可反映再狭窄情况。

有研究显示，葛根素对再狭窄的形成可发挥一定的抑制作用，抑制大鼠球囊损伤部位再狭窄[18]。Guo等[19]研究显示，Wnt信号通路在细胞正常生长发育中发挥着重要的作用。Liu等[20]研究显示，信号通路参与调节血管平滑肌细胞(VSMC)发育及损伤后增殖，大鼠颈动脉受损后Wnt通路的某些信号分子异常表达，可能参与调控中膜平滑肌细胞增殖、迁移及内膜新生过程。上述研究说明，Wnt信号通路参与调节VSMC发育及损伤后增殖过程，颈动脉球囊损伤术再狭窄大鼠Wnt1、Wnt3a水平降低，通过抑制Wnt信号通路可调控成纤维细胞增殖及心脏重构过程中内皮间质转化，抑制血管损伤处内皮生长。

综上所述，葛根素基于Wnt信号通路能减小颈动脉球囊损伤术再狭窄大鼠颈动脉管腔面积，通过调控Wnt1、Wnt3a蛋白减轻大鼠血管损伤，为临床治疗颈动脉球囊损伤术再狭窄提供参考。

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