基于线粒体凋亡通路探究右美托咪定对心肌缺血再灌注模型大鼠的干预效果

王丽 王少微 贾彤 孙晓佳 邢珍 刘辉 姚杰 陈艳林

(河北北方学院附属第一医院麻醉科，河北 张家口 075000)

心肌缺血是一种病理生理状态，是由于心脏的血液灌注量减少，从而导致心脏供氧不足，心肌能量代谢异常的现象〔1,2〕。有研究表示，冠心病、变异性心绞痛、心肌桥等是主要病因〔3〕。据流行病学调查显示，中老年人为易发人群，男性发病人数高于女性，发达国家发病率较高，近年来该病发病率呈年轻化趋势，严重威胁着患者的健康〔4,5〕。右美托咪定是一种注射剂，具有镇定安神的作用〔6〕。本研究建立心肌缺血再灌注大鼠模型，分析右美托咪定对心肌缺血再灌注模型大鼠线粒体凋亡通路的影响，旨在探讨右美托咪定是否经线粒体凋亡通路参与该病的发生发展。

1.1材料 选取40只SPF级雄性大鼠(山东轩竹医药科技有限公司，使用许可证号：SYXK(鲁)20200001)，2～4月龄，平均(3.1±0.8)月龄；
体重265～312 g，平均体重(288.5±18.8)g。在相对湿度40%～65%、温度(24.1±2.6)℃的环境中适应性喂养1 w。本试验严格按照动物实验伦理要求进行操作，且通过医院伦理委员会审批同意。主要试剂：小鼠抗大鼠白细胞介素(IL)-6、超氧化物歧化酶(SOD)抗体(BD公司)、小鼠抗兔C反应蛋白(CRP)抗体(Dako公司)、兔抗小鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(Gibco公司)、大鼠抗兔丙二醛(MDA)抗体(上海国药集团化学试剂有限公司)、大鼠抗小鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)抗体(Sigma公司)、兔抗大鼠细胞色素(Cyto)C、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗体(Hyclone公司)。主要仪器：多道生理记录仪(河南华南医电科技有限公司)、光学显微镜(上海炳宇光学仪器有限公司)、流式细胞仪(天津众立生物科技有限公司)、小动物呼吸机(天津仪数科技有限公司)、彩色多普勒超声诊断仪(徐州贝尔斯电子科技有限公司)、PE50动脉导管(上海瑾瑜科学仪器有限公司)。

1.2分组及建模 随机选取10只大鼠作为正常组，剩余30只大鼠参照罗敏等〔7〕研究建立心肌缺血再灌注模型，30只雄性大鼠分别禁食12 h，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位进行固定，小动物呼吸机机械通气，四肢皮下插入电极，连接心电图。在大鼠胸骨左缘第4肋间逐层打开胸腔，充分暴露心脏和血管，结扎左冠状动脉前降支，诱发心肌缺血30 min，然后松开结扎线再灌注60 min。心肌缺血再灌注造模成功的标志，心电图ST段明显抬高、T波高耸。建模过程中大鼠死亡2只，将剩余的28只大鼠，随机分为再灌注组、右美托咪定组各14只，在灌注组建模前2 h静脉注射氯化钠溶液，右美托咪定组建模前2 h静脉注射右美托咪定，正常组未做处理。

1.3样本采集 各组大鼠注射戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，2 000 r/min离心10 min,离心半径10 cm，分离血清-40℃保存。处死大鼠取其心脏组织，将大鼠心脏组织置于丙酮-干冰饱和溶液中，石蜡包埋保存，以便后续指标检测。

1.4多道生理记录仪检测心脏血流动力学水平 将大鼠注射戊巴比妥钠麻醉后，分离右颈总动脉，将PE50动脉导管经右颈总动脉插入左心室，固定后用多道生理记录仪，检测并记录左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压下降最大速率(-dp/dt)、左室内压上升最大速率(+dp/dt)水平。

1.5苏木素-伊红(HE)染色和梗死面积检测 取出包埋后标本，垂直连续切片，将标本脱蜡处理，用苏木素浸泡、染色，2%盐酸酒精分化，使用自来水充分清洗，1%浓度伊红染色，酒精浸泡、脱水，中性树胶封片，放置显微镜下观察。染色完毕后，用多聚甲醛固定，称重，ImageJ图像分析软件计算大鼠的心肌梗死面积。

1.6酶标分析仪检测炎症因子水平 将待测血清按比例稀释，酶标板添加100 μl待测血清、标准液，震荡均匀，恒温箱静置60 min，每孔加洗涤液浸泡2 min，甩干，反复洗板3次，每孔加40 μl蒸馏水、一抗，混合均匀，恒温静置30 min，重复洗涤步骤，每孔加酶标抗体60 μl，37℃静置15 min，每孔加底物液60 μl，避光静置10 min，每孔加终止液60 μl。在酶标板450 nm处测吸光值，计算IL-6、CRP、TNF-α水平。

1.7流式细胞仪检测氧化应激因子水平 取两个标记为待测管、对照管的试管备用，对照管和待测管分别加100 μl标准液、待测血清和40 μl蒸馏水、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝液，两管均加有荧光标记物的单克隆抗体，待测管再加有荧光标记物的免疫球蛋白20 μl，恒温放置30 min，两管均加溶血剂静置15 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，反复洗涤2次，添加磷酸盐缓冲液(PBS)100 μl悬浮细胞，流式细胞仪检测MDA、GSH-Px、SOD水平。

1.8Western印迹法检测CytoC、Caspase-3通路蛋白相对表达量 待测血清用细胞裂解液裂解，测定待测血清中的蛋白浓度，加入适量的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶，沸水水浴加热5 min，以充分蛋白变性，使用NC膜转模，Western洗涤液漂洗2 min，加Western封闭液，恒温静置60 min，加Western一抗稀释液，恒温孵育60 min，回收一抗，加洗涤液漂洗5 min，反复洗涤3次，加入Western二抗稀释液由辣根过氧化物酶(HRP)标记，恒温孵育60 min，回收二抗，充分洗涤后显色、成像。

1.9统计学处理 采用SPSS25.0进行重读测量方差分析、独立样本t检验。

2.1各组心房肌组织病理学观察 正常组心肌组织结构完整、排列整齐，肌原纤维分布规则；
再灌注组心肌组织排列稀疏、杂乱，细胞内有明显水肿，肌原纤维有断裂现象；
右美托咪定组心肌组织排列较紧密，细胞内水肿减轻，肌原纤维断裂现象明显改善。见图1。

图1 各组心肌组织HE染色观察(×200)

2.2各组心脏血流动力学水平和梗死面积比较 如表1所示，与正常组比较，再灌注组、右美托咪定组LVSP、-dp/dt、+dp/dt水平较低，LVEDP水平较高，具有统计学差异(P<0.05)；
与再灌注组比较，右美托咪定组LVSP、-dp/dt、+dp/dt水平较高，LVEDP水平较低，具有统计学差异(P<0.05)。与再灌注组比较，右美托咪定组梗死面积较小，具有统计学差异(P<0.05)。

2.3各组炎症因子水平比较 如表2所示，与正常组比较，再灌注组、右美托咪定组IL-6、CRP、TNF-α水平较高，具有统计学差异(P<0.05)；
与再灌注组比较，右美托咪定组IL-6、CRP、TNF-α水平较低，具有统计学差异(P<0.05)。

2.4各组氧化应激因水平比较 如表2所示，与正常组比较，再灌注组、右美托咪定组MDA水平较高，GSH-Px、SOD水平较低，具有统计学差异(P<0.05)；
与再灌注组比较，右美托咪定组MDA水平较低，GSH-Px、SOD水平较高，具有统计学差异(P<0.05)。

表1 各组心脏血流动力学水平和梗死面积比较

表2 各组炎症因子、氧化应激水平比较

2.5各组线粒体凋亡通路蛋白相对表达量对比 如表3、图2所示，与正常组比较，再灌注组、右美托咪定组各蛋白表达量较高，具有统计学差异(P<0.05)；
与再灌注组比较，右美托咪定组各蛋白表达量较低，有统计学差异(P<0.05)。

表3 各组线粒体凋亡通路蛋白相对表达量对比

1～3：正常组、再灌注组、右美托咪定组图2 各组线粒体凋亡通路蛋白表达

心肌缺血是由于冠状动脉狭窄、痉挛、栓塞等引起的心肌供血、供氧不足，主要分为心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、猝死四个类型〔8〕。心肌缺血确诊后需长期治疗，患者主要表现为心悸、头晕、胸闷等常伴随全身乏力、水肿、发热甚至引发休克，严重威胁患者的生命〔9,10〕。临床常用药物对患者治疗，但由于心肌缺血发病机制复杂，尚无特效药，因此寻找安全有效药物是治疗心肌缺血的关键〔11〕。

梗死面积是判定心肌缺血再灌注损伤的公认指标，心肌梗死是心肌组织的不可逆损伤，故心肌缺血再灌注大鼠模型梗死面积越大，表明其心肌组织的损伤度越高〔12,13〕。本文研究表明，使用右美托咪定处理大鼠，能有效减少大鼠梗死面积，提升心肌缺血再灌注大鼠的心肌保护力。

右美托咪定是一种具有强效、高选择性的α2肾上腺素受体激动药物，有镇静、镇痛、稳定血流动力学、呼吸抑制较轻的特点〔14〕。有学者研究表示，右美托咪定+咪达唑仑联合用药有助于缓解体内炎症反应，从而有效减轻心肌组织的损伤〔15〕。右美托咪定可通过调控IL-6、IL-3、LVSP、LVEDP水平，减轻心肌缺血再灌注过程中炎症反应的发生，提高机体血流动力学水平，从而起到保护心肌组织的作用〔7〕。分析其原因可能是由于炎症反应可参与心肌损伤的过程相关，当炎症因子水平被抑制后，其心肌组织的损伤可明显减轻，心室功能得到明显改善；
心脏血流动力学水平的提升，可使心脏供血、供氧能力提升，从而弱化其损伤的过程〔16〕。本文研究表明，经右美托咪定处理后，心肌缺血再灌注大鼠血流动力学水平提升、炎症因子水平下降，从而使心肌组织损伤明显降低，进而抑制心肌组织进一步损伤，促进其相关功能的修复。

线粒体是调节大部分凋亡通路的细胞器，可通过多种应力刺激激活，导致线粒体外膜的改变〔17〕。CytoC由CYCS基因编码，是一种高度保守的蛋白质，从线粒体泄露出CytoC可诱导细胞凋亡；
Caspase-3属于Caspase家族，是细胞凋亡的效应器，与众多底物作用，导致凋亡细胞发生特有改变〔18,19〕。目前已有研究显示，促凋亡蛋白CytoC的增加和释放可激活Caspase-3的活性，可导致心肌细胞的凋亡，最终导致心脏功能损伤〔20〕。本研究结果表明右美托咪定可能经促进线粒体凋亡通路相关蛋白失活，有效阻止心肌细胞的程序性死亡，从而保护心肌细胞。

虽然本文结果显示，右美托咪定可能通过促进线粒体凋亡通路失活，抑制心肌组织损伤，但目前临床研究并没有显示右美托咪定、促进线粒体凋亡通路与心肌缺血再灌注的关系，且本研究例数较少，存在一定的局限性，因此该结果仍需进一步证实，以期为临床心肌缺血再灌注的诊治提供新的思路。

综上所述，使用右美托咪定对心肌缺血再灌注大鼠进行治疗，能有效改善心脏血流动力学水平，缓解炎症反应的发生，提高机体抗氧化能力，减少梗死面积，其作用机制可能促使线粒体凋亡通路信号通路失活。

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