温阳逐瘀汤对肾阳虚脑缺血损伤大鼠SDF-1、CXCR4表达的影响

韦亮 祝美珍 孙诗杰 苏萍 何宏盾

(广西中医药大学，广西 南宁 530000)

脑缺血损伤又称缺血性脑卒中(ICVD)，是由于各种原因引起脑血管梗死不通，局部脑组织缺血缺氧进而引起神经细胞凋亡、细胞自噬等一系列病理过程，出现偏瘫、失语等神经功能缺损症状，甚至危及生命〔1〕。ICVD是我国最常见的脑卒中类型，其发病率高、致死致残率高，占我国脑卒中发病类型的69.6%～70.8%〔2〕。脑缺血发生后，及早地再灌复流是治疗ICVD的重点与关键〔3〕。加快侧支循环的建立可改变血流通过路径并提供反向血流灌注，增加血液灌注，保持脑血容量，改善脑缺血症状〔4〕。基质细胞衍生因子(SDF)-1/CXC趋化因子受体(CXCR)4信号通路，被认为是能激活一条细胞间信号传导及细胞迁移的信号通路，可以调节造血细胞、炎症细胞和内皮祖细胞等多种细胞的迁移、分化、增殖及神经发生等生物学行为〔5〕，从而促进新的血管生成，增加脑血流量的灌注，改善脑损伤，起到脑保护的作用。干预和调控SDF-1、CXCR4的表达水平，可使SDF-1/CXCR4信号通路发挥其最大的生物学效应。本研究根据ICVD“肾阳不足-痰瘀互结-痹阻脑络”的重要病机链锁，基于ICVD的证候病机与分子病理，研究温阳逐瘀汤对肾阳虚ICVD大鼠侧支循环建立相关指标SDF-1、CXCR4表达的影响，探索其促进脑缺血组织侧支循环建立的分子机制，为中医药防治ICVD提供新的研究思路。

1.1动物 192只SPF级SD雄性大鼠，鼠龄3～4个月，体重(250±25)g，购自广西医科大学动物实验中心，许可证号：SYSK桂2014-0003。

1.2药物 温阳逐瘀汤：制附子10 g、肉桂5 g、杜仲15 g、巴戟天15 g、当归10 g、熟地20 g、桃仁10 g、红花10 g、水蛭8 g、姜半夏9 g、南山楂15 g、红参10 g；
每剂含137 g生药，药材购自广西中医药大学第一附属医院；
氢化可的松注射液，福安药业集团湖北人民制药有限公司，市售，批号H20058654。

1.3仪器及试剂 超低温冰箱(澳柯玛)、高速台式冷冻离心机(德国 Eppendorf 公司)、垂直电泳仪(美国 BIO-RAD)、全自动实时荧光定量 PCR仪(瑞士 LightCycler96)、酶联免疫分析试剂盒(武汉基因美，生产批号：GR2020-05)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒〔北京索莱宝，货号：PC0020-500微孔(50T)〕、高效 RIPA 裂解液(北京索莱宝，货号：R0010-100ml)、预染彩虹蛋白marker〔北京索莱宝，货号：PR1910-50T(250 μl)〕、山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗(北京中杉金桥)、TRIZOL裂解液(美国Invitrogen)、SDF-1、CXCR4单克隆抗体(英国 abcam 公司)、反转录试剂盒(莫纳生物科技有限公司)、扩增试剂盒(莫纳生物科技有限公司)、SDF-1和CXCR4引物及内参(上海生工股份有限公司)、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司) 。

1.4动物分组 将192只成年健康雄性SD大鼠按体重进行分层及编号，使用SPSS24.0统计软件随机数字表法进行随机分组，先分为空白组48只和肾阳虚模型组144只，肾阳虚模型组肌肉注射氢化可的松注射液21 d后，建立肾阳虚模型，再将造模成功后的144只肾阳虚模型大鼠按体重进行随机分组，分为假手术组、模型组、温阳逐瘀汤组，每组各48只。

1.5模型制备

1.5.1肾阳虚模型 空白组正常喂养，肾阳虚模型组连续21 d早8∶00～9∶00进行腿部肌肉注射氢化可的松注射液，25 mg/kg〔6〕，自由饮食、饮水。每日造模前后测量观察各组大鼠的体重、进食量、饮水量、一般状态及二便并记录。

1.5.2ICVD模型 将完成肾阳虚造模后的模型组、温阳逐瘀汤组大鼠用10%水合氯醛麻醉后，参考Longa等〔7〕法制成大鼠急性ICVD模型。假手术组线栓插入大鼠右侧颈总动脉(0.8±0.2)cm，此深度不足以阻断大脑中动脉血流。参考 Longa〔7〕的评分法对造模后大鼠进行神经功能评分筛选出符合要求的ICVD模型。

1.6药物干预 以体重60 kg成人每天服用温阳逐瘀汤，参考《现代医学实验动物学》〔8〕中的标准方程进行换算，按体量1 ml/100 g进行灌胃；
分别于每日上午9∶00～10∶00及下午16∶00～17∶00时进行灌胃，空白组、假手术组、模型组给予蒸馏水灌胃，温阳逐瘀汤组予以温阳逐瘀汤灌胃，药物浓度含生药材2 g/ml，直至各时间点取材。

1.7标本采集及处理 ①采血：对大鼠进行尾静脉采血1 ml，用含肝素钠采血管收集，置数小时后取血清，3 000 r/min离心10 min，-80℃保存；
②取脑：使用10%水合氯醛麻醉后进行取脑，将用于HE检测的脑组织浸于4%的多聚甲醛，而用于Western检测和RT-PCR检测的脑组织放入-80℃冰箱冻存。

1.8检测方法 ①采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肾阳虚证模型造模后及灌胃后的肾阳虚特异性指标环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)；
②采用Western印迹和实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测各时间点脑组织SDF-1、CXCR4的mRNA及蛋白表达水平；
③HE染色法检测各时间点缺血损伤侧神经细胞形态学变化。

1.9统计学方法 采用SPSS24.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、SNK-q检验、重复测量资料方差分析、秩和检验。

2.1肾阳虚模型症状及指标

2.1.1症状及体征 空白组大鼠始终保持皮毛光泽，反应敏捷，二便正常；
肾阳虚模型组大鼠从7 d开始出现皮毛色泽暗淡、枯槁欠光亮，体毛疏松，轻微脱毛现象，倦怠萎靡，懒动喜卧，行动缓慢，大便质软；
14 d后出现竖毛，脱毛明显，反应迟钝，畏冷蜷缩，弓背眯眼，阴囊皱缩，睾丸回升，饮食减少，小便频数，大便稀溏等症状；
21 d后上述症状加重；
与空白组相比，肾阳虚模型组大鼠体重呈缓慢增长，14 d、21 d明显下降(P<0.01)，提示肾阳虚模型造模成功，见表1。

2.1.2肾阳虚证特异性指标cAMP、cGMP水平的变化 与空白组比较，肾阳虚模型组血清cAMP水平明显降低，cGMP水平明显升高，cAMP/cGMP比值明显降低(P<0.01)，提示肾阳虚模型造模成功，见表1。

表1 空白组和肾阳虚模型组不同时间点体重及cAMP、cGMP比较

2.2大鼠神经功能缺损评分 空白组与假手术组大鼠的神经功能表现正常。同一时间点与假手术组相比，模型组和温阳逐瘀汤组神经功能缺损评分显著升高(P<0.05)；
与模型组相比，温阳逐瘀汤组在各时间点的神经功能缺损评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示ICVD模型成功，见表2。

表2 各组不同时间点神经功能缺损评分比较分)

2.3各组缺血侧脑组织病理 空白组、假手术组：细胞排列规整，胞膜完整，形态结构基本正常；
模型组：细胞排列紊乱稀疏，大量细胞坏死，呈明显的缺血性损害改变；
温阳逐瘀汤组：细胞排列稀疏紊乱，但与模型组相比较为整齐，部分细胞坏死，呈三角形收缩并深染，胞膜消失，核仁呈紫蓝色，有少量炎性细胞浸润；
随着灌胃给药时间的延长，与模型组相比，温阳逐瘀汤组细胞明显逐渐增多，胞膜相对完整，胞质呈浅紫色，胞核逐渐清晰可见，见图1。

2.4各组大鼠脑组织SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表达水平比较 同一取材时间点相比，空白组、假手术组SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)；
与假手术组相比，模型组、温阳逐瘀汤组SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.01)；
模型组、温阳逐瘀汤组SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表达水平均于7 d达到峰值，14、21 d表达逐渐下降，且SDF-1与CXCR4蛋白及mRNA表达趋势相同；
同一取材时间点相比，温阳逐瘀汤组SDF-1与CXCR4蛋白及mRNA表达高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)。提示温阳逐瘀汤可明显上调SDF-1、CXCR4蛋白及mRNA表达水平，见表3、图2、表4。

表3 各组不同时间点脑组织SDF-1、CXCR4蛋白表达水平

1～4:空白组，假手术组，模型组，温阳逐阏汤组

表4 各组不同时间点脑组织SDF-1、CXCR4 mRNA相对量表达水平比较

ICVD发生后，尽早恢复缺血灶的血流量是治疗的重要切入点，也是降低的致残率、致死率的关键。临床研究结果表明，ICVD发生后，随着侧支循环的开放，患者发生脑梗死的数量及梗死面积显著减少，可明显降低ICVD的复发率〔9,10〕。研究证实，ICVD大鼠缺血侧脑组织中SDF-1及CXCR4的含量显著高于对侧未受损脑组织〔11〕。以SDF-1、CXCR4为主要转导因子的SDF-1/CXCR4信号通路，在治疗脑缺血损伤中发挥着重要的作用，其主要作用机制大致可分为以下三方面：①诱导干细胞和内源性祖细胞通过增加的梗死周围的SDF-1和表达CXCR4来上调营养因子〔12〕。②调动内皮祖细胞等促进血管新生:被释放的SDF-1可以促进成熟或未成熟的造血细胞、平滑肌细胞前体细胞和内皮前体细胞等促进血管细胞的生成，恢复缺血组织的血流灌注；
而CXCR4也可以直接或间接地生成这些促血管生成细胞，从而一同达到血管新生的目的〔13,14〕。③提高机体抗缺氧能力〔15〕。

SDF-1属于趋化因子蛋白家族中的一员，可作为趋化细胞因子参与细胞活化、分化和运输〔16〕。SDF-1在缺血灶中表达的上调主要是从损伤后3 d开始，于7 d达到高峰，且能持续表达至30 d〔17〕。SDF-1有CXCR7、CXCR4两大受体，但CXCR7是通过CXCR4才能发挥对SDF-1进行的信号转导，所以认为CXCR4是SDF-1的唯一特异性受体〔18〕。CXCR4作为一类G蛋白耦联受体，它由7个疏水性跨膜区组成，能表达于不同细胞膜上和细胞质中，能正向诱导内源性神经干细胞、祖细胞向组织损伤处迁移及归巢，在受损的中枢神经系统的恢复上起到关键作用。

脑卒中多发于中老年人，其病机特点为本虚标实。中医认为，肾为五脏六腑之本，肾气为元气之根。年老肾虚，气虚无力畅行血脉，阳虚无力温化津血，则痰瘀内生，痹阻脑脉而发为脑卒中。“肾阳不足-痰瘀互结-痹阻脑络”是ICVD的主要病机，治宜谨守病机，无失气宜，以温阳通脉、逐瘀通络为法。一则温补肾阳、逐瘀通脉恢复局部缺血脑组织的血液供应，挽救缺血半暗带组织；
二则温补肾阳，化瘀生新，促进血管新生，建立侧支循环，进一步恢复脑部血流，改善脑缺血损伤预后、实现脑保护。

温阳逐瘀汤方中以附子、肉桂共为君药，同归肾经，共奏补火助阳、温肾固本之效；
臣以杜仲、巴戟天、红参补肾助阳、益气培元，共助君药温补肾阳；
佐以熟地滋阴活血、亦有阴中求阳之意；
当归、桃仁、红花、水蛭补血活血、逐瘀通经；
半夏、山楂行气化痰。全方温补肾阳、化痰逐瘀，切断ICVD“肾阳不足-痰瘀互结-痹阻脑络”的病机链锁，获得“温肾阳-祛痰瘀-生新络”的治疗效应。

本研究结果证明，温阳逐瘀汤可明显改善肾阳虚ICVD大鼠畏寒蜷缩、四肢冰凉、大便稀溏、体质量下降等的阳虚表征及肾阳虚证特异性指标，可能系方中附子、肉桂、杜仲等归肾经的温阳药，共奏温肾固本之效，改善了大鼠肾阳虚证的症状；
实验灌胃温阳逐瘀汤后，肾阳虚ICVD大鼠缺损的神经功能与模型组相比得以良好的改善，缺血组织脑细胞损伤程度明显减轻，可能系方中当归、红花、桃仁、半夏等活血、化痰、祛瘀之品，复通脑脉，增加了缺血的脑组织的血流灌注量，从而修复损伤的脑细胞及神经功能；
大鼠脑组织SDF-1、CXCR4的mRNA及蛋白表达水平明显上调，可能系全方在温补肾阳、逐瘀化痰的基础上，活血生脉，导致参与血管新生因子表达上调，从而增加损伤区域的脑血流灌注量。

综上所述，温阳逐瘀汤可以明显改善肾阳虚型ICVD大鼠的肾阳虚表现，降低ICVD大鼠神经功能缺损评分,其作用机制可能是通过上调缺血侧脑组织中的SDF-1、CXCR4的mRNA及蛋白表达水平，促进缺血损伤局部血管新生，改善ICVD的神经功能损伤，实现脑保护，从而发挥其防治ICVD的作用。

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