基于网络药理学及体外实验探究黄连阿胶汤治疗抑郁症的机制Δ

程 硕，谭 琰，丁成成，陈伟航，彭甜甜，张亚丽，王雅蕾，张华伟，李海燕，张佳妮，刘肇恒，王 旭，华 茜#(.北京中医药大学中医学院，北京 0009；

.北京中医药大学生命科学学院，北京0009；

.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 0009)

黄连阿胶汤出自《伤寒论》，为安神剂-交通心肾剂，具有心肾交合、水升火将、滋阴泄火的功效，可用于抑郁症的治疗。网络药理学通过建立靶点、疾病、药物成分之间的相互作用关系图，从整体性和系统性2个方面认识疾病的本质，这与中药的整体观、辨证论治原则相一致。本研究基于网络药理学理论，对黄连阿胶汤治疗抑郁症的作用机制进行探讨，然后基于PC12细胞进行验证。

1.1 网络药理学

1.1.1 黄连阿胶汤有效成分及靶点获取：黄连阿胶汤的主要成分为黄连、黄芩、芍药、阿胶和鸡子黄。利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、中药综合数据库、中药与化学成分数据库对5种药物进行有效成分及靶点的检索，将口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18作为筛选条件对其进行筛选，基于Uniprot数据库获取靶点官方基因名。

1.1.2 抑郁症相关靶点的获取：以“Depression”为关键词输入至人类孟德尔遗传综合数据库、DrugBank、GeneCards、治疗靶点数据库及Pharmgkb等数据库中获取相关靶点，GeneCards数据库获得的靶点以相关性评分≥10分作为筛选条件[1]。将黄连阿胶汤的靶点与抑郁症的靶点输入Venn平台中，获取交集靶点。

1.1.3 “药物-成分-靶点”网络图的构建：将黄连阿胶汤中的有效成分、作用靶点输入Cytoscape 3.7.2软件中，基于Network Analyzer功能，构建药物成分与靶点之间的网络图。

1.1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图的构建及核心靶点的筛选：将交集靶点输入平台STRING中，物种设定为“Homo sapiens”，最低互动得分设置为0.4，得到PPI图。利用软件Cytoscape 3.7.2对结果进行分析，以Average Shortest Path Length、Betweenness Centrality、Closeness Centrality和Degree中位数作为筛选条件筛选核心靶点[2]。通过GEO数据库中GSE12654与GSE76826芯片分析核心靶点在抑郁症患者体内的表达情况。

1.1.5 京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析：将交集靶点输入到DAVID平台中，物种设置为“Human”，进行GO及KEGG富集分析。

1.1.6 分子对接：基于软件AutoDockTools 1.5.6，对前10个有效成分和前10个核心靶点进行分子对接。基于PyMol软件获取对接模型图。

1.2 体外实验

1.2.1 仪器：QuantStudioTM3型荧光定量PCR仪(美国Agilent公司)；
SeriesⅡ WJ型细胞培养箱(美国Thermofisher公司)；
Allegra V-15R型离心机(美国Beckman Coulter公司)。

1.2.2 药品与试剂：黄连阿胶汤药材购自北京同仁堂有限公司，其中黄连12 g(批号：20220905)，黄芩6 g(批号：22060401)，芍药6 g(批号：22012402)，阿胶9 g(批号：22031402)，鸡子黄2枚。将药物用水浸泡30 min，然后煎煮1 h进行过滤，药渣加水继续煎煮30 min，进行过滤，然后合并滤液进行浓缩，加入鸡子黄，将药液浓缩至2 g/mL。多皮质酮(CORT，HPLC≥98%)、槲皮素(HPLC≥98%)、黄芩素(HPLC≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司。RPMI-1640培养基(#R8758)购自美国Sigma公司。CCK8试剂盒(#HY-K0301)购自美国MedChemExpress公司。

1.2.3 细胞培养：将PC12细胞置于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养24 h，培养基为RPMI-1640培养基，其中添加10%热灭活的胎牛血清、5%马血清和1%的青霉素/链霉素。

1.2.4 分组与给药：将细胞分为空白组、模型组、槲皮素组以及黄芩素组。模型组、槲皮素组以及黄芩素组加入终浓度为200 μmol/L的CORT培养基溶液，空白组加入等体积细胞培养基。各组培养3 h后，槲皮素组和黄芩素组分别加入60 μmol/L的槲皮素和80 μmol/L的黄芩素，继续培养12 h后进行后续实验。

1.2.5 细胞活性测量：CCK8试剂盒用于测试细胞的活性。将细胞以5×104个/孔的密度种植于96孔板中，培养24 h，然后每孔添加CCK8溶液10 μL，继续培养1 h，测定其活性。

1.2.6 实时定量聚合酶链反应：将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)进行清洗，加入裂解液，离心后获得RNA沉淀，测定RNA的浓度与完整性，然后将RNA反转录成cDNA，以便进行扩增。实验中内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。

2.1 网络药理学

2.1.1 黄连阿胶汤有效成分的筛选：通过检索及筛选，共得到有效成分73种，其中黄连12种，黄芩36种，白芍8种，鸡子黄5种，阿胶16种，其中谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)为白芍与黄芩的共有成分，表小檗碱(epiberberine)、黄连碱(coptisine)为黄连与黄芩的共有成分。共得到靶点577个。

2.1.2 疾病靶点的筛选：对数据库进行筛选获得抑郁症靶点3 157个，黄连阿胶汤与抑郁症的交集靶点283个，见图1(A)。

A.药物-疾病靶点交集；
B.成分-疾病靶点图；
C.PPI图；
D.核心靶蛋白相互作用图；
E.核心靶点临床表达差异A. drug-disease target intersection; B. component-disease target; C. PIP; D. interaction of core target protein; E. different clinical expression of core targets图1 黄连阿胶汤治疗抑郁症的核心靶点筛选Fig 1 Screening of core targets of Huanglian Ejiao decoction in the treatment of depression

2.1.3 “药物-成分-靶点”网络图构建：“药物-成分-靶点”网络图共有361个节点，1 077条边，形状越大表示连接度越高；
槲皮素及黄芩素连接的靶点最多，见图1(B)。

2.1.4 PPI网络图的构建及核心靶点的筛选：PPI网络共有280个节点，6 181条边，见图1(C)。对PPI图进行4次筛选得到核心靶点5个，见图1(D)，分别为白细胞介素(IL)1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和信号转导及转录激活因子3(STAT3)，主要涉及炎症因子、功能生长因子等。通过GEO数据库对核心靶点的表达进行分析，见图1(E)，核心靶点的表达均具有显著性差异。

2.1.5 GO和KEGG富集分析：GO功能富集分析主要涉及缺氧反应、突触后膜和质膜等。KEGG通路富集分析主要涉及缺氧诱导因子(HIF)1、TNF和环磷酸腺苷(cAMP)信号通路等，见图2(A—B)。通路之间并非相互独立，不同通路之间拥有共同靶点，见图2(C)。图2(D)为HIF-1信号通路示意图，涉及上游信号IL-6、表皮生长因子(EGF)以及下游信号VEGFA、一氧化氮合酶(NOS3)等。

A.GO富集分析柱状图；
B.KEGG富集分析气泡图；
C.靶点-通路图；
D.HIF-1信号通路A. histogram of GO enrichment analysis; B. bubble plot of KEGG enrichment analysis; C. target-pathway network diagram; D. HIF-1 signal pathway图2 黄连阿胶汤治疗抑郁症的核心靶点分析Fig 2 Analysis on core targets of Huanglian Ejiao decoction in the treatment of depression

2.1.6 分子对接结果：共得到100组配体-受体结果，见图3(A)。所有的结合能均<-5 kJ/mol，66组结合能<-21 kJ/mol，占66%。此对接结果可以为今后药物的筛选提供支撑。

A.分子对接结合能热图(单位：kJ/mol)；
B.分子对接示意图(a.N-反式-阿魏酰基酪胺与VEGFA；
b.β-谷甾醇与INS；
c.豆甾醇与SRC)A. binding energy heatmap for molecular docking (Unit: kJ/mol); B. schematic diagram of molecular docking(a. moupinamide and TNF; b. beta-sitosterol and INS; c. stigmasterol and SRC)图3 小分子配体与大分子受体的分子对接Fig 3 Docking of small molecule ligands to macromolecular receptors

2.2 体外实验

2.2.1 皮质酮、黄连阿胶汤对细胞活性的影响：本研究设置4种不同浓度的皮质酮对细胞进行刺激，如图4(A)所示，随着皮质酮浓度的升高，细胞活性逐渐降低，当皮质酮浓度为200 μmol/L时，细胞活性为63%，因此本研究选择该浓度进行后续的实验。由图4(B—C)可知，当槲皮素及黄芩素的浓度分别低于60 μmol/L和80 μmol/L时对细胞活性无影响，本研究选择该浓度进行后续实验。

A.CORT；
B.槲皮素；
C.黄芩素；
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001A. CORT; B. quercetin; C. baicalein; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001图4 不同单体对细胞活性的影响Fig 4 Effects of monomers on cell viability

2.2.2 黄连阿胶汤对PC12细胞活性及核心靶点表达的影响：与CORT组相比，槲皮素组和黄芩素组细胞活性均有所改善，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明槲皮素及黄芩素能够有效改善皮质酮对PC12细胞的损伤，见图5(A)。与对照组相比，CORT组可使炎症因子IL-1β mRNA、IL-6 mRNA和细胞因子STAT3 mRNA表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，而槲皮素、黄芩素能够逆转这种趋势，见图5(B—D)。

A.槲皮素及黄芩素对细胞的活性影响；
B—D.槲皮素及黄芩素对IL-1β、IL-6及STAT3表达的影响A. effects of quercetin and baicalein on activity of model cells; B-D. effects of quercetin and baicalein on expression of IL-1β, IL-6 and STAT3图5 槲皮素和黄芩素对细胞活性及靶点表达的影响Fig 5 Effects of quercetin and baicalein on cell activity and target expression

3.1 黄连阿胶汤治疗抑郁症的理论基础

抑郁症属于中医学“郁症”“脏燥”和“百合病”等范畴，其病因主要为气机郁滞、气血阴阳失调等，主要表现为肝肾阴亏、阴虚内热，导致神明失养，产生焦虑及抑郁的精神症状。因此，国医大师阮士怡认为可以通过“滋阴补肾”对抑郁症进行治疗[3-4]。黄连阿胶汤中，味苦的黄连与黄芩能够泄心火，使心气下交于肾，达到除阳目的[5]；
其他3味药白芍、阿胶和鸡子黄能够滋肾阴，使肾水上济于心，达到补阴的目的；
所有药物合用，心肾交合，水升火将，滋阴泻火，正与抑郁症的病因相克，故在临床中黄连阿胶汤治疗抑郁症取得了良好的效果。

3.2 黄连阿胶汤治疗抑郁症的成分分析

由成分-靶点通路图可知，槲皮素及黄芩素可能在黄连阿胶汤治疗抑郁症中发挥重要作用。槲皮素作为黄连的主要成分之一，具有抗氧化、抗炎和神经保护等作用。有研究结果表明，槲皮素可以改善模型小鼠的抑郁样行为，提高海马区脑因子1、脑源性神经营养因子(BDNF)等表达水平，增强神经细胞的可塑性[6]。Mehta等[7]研究了槲皮素对抑郁模型小鼠大脑内氧化应激及神经炎症的影响，结果表明，槲皮素可以显著降低海马区氧化应激及神经炎症，减轻抑郁症状。

黄芩素具有抗氧化应激、抗炎和促进神经保护因子表达等多种药理作用，对神经系统疾病具有良好的预防及治疗作用[8-9]。Xiong等[10]研究了黄芩素对抑郁症动物的治疗作用，结果发现通过注射黄芩素，可以显著降低小鼠强迫游泳实验与悬尾试验的不动时间，逆转海马细胞外BDNF表达水平的降低，加强神经可塑性。

3.3 黄连阿胶汤治疗抑郁症的靶点分析

由PPI图可知，黄连阿胶汤治疗抑郁症的核心靶点主要包括IL-1β、IL-6、STAT3、蛋白激酶B(Akt)1、TNF和VEGFA。其中IL-1β、IL-6和TNF属于炎症因子，有研究结果表明，在抑郁症中，炎症反应会激活HPA轴，HPA轴的刺激会导致促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放[11]。Köhler等[12]对抑郁症患者及健康患者的细胞因子及趋化因子进行统计回顾及Meta分析，结果表明，与健康者相比，抑郁症患者体内IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著增加，说明炎症因子与抑郁症密切相关。

Akt1作为磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路下游的产物，与抑郁症密切相关[13]。Akt1以性别特异性的方式影响焦虑样行为，Akt1KO雄性小鼠增加了焦虑样行为[14]。PIK3CA-Akt1信号通路的激活在抑郁的嗅球切除大鼠模型中发挥抗抑郁样作用[15]。有研究结果表明，Akt可以调节抗抑郁药的功能，并有助于突触可塑性和神经传递的形成[9]。

STAT3在5-羟色胺能神经元系统中起着至关重要的作用，是控制情绪反应的分子介质[16]。STAT3的激活可以反映与神经功能相关的上游调节因子的作用，包括生长因子、激素和内源性大麻素等[17]。Kwon等[18]的研究结果发现，小胶质细胞中STAT3的功能障碍增强了巨噬细胞集落刺激因子对神经功能的作用，并通过抗抑郁途径上调BDNF表达，从而减轻了与抑郁相关的行为。

VEGFA是一种多功能生长因子[19]。有研究结果表明，VEGFA在神经保护和神经发生过程中发挥重要作用，并且可能参与某些神经系统疾病的发病机制[20]。Cui等[21]研究了抑郁模型大鼠海马组织和血清中VEGFA的表达变化，结果表明，其海马区及外周血的VEGFA mRNA和蛋白的表达均降低，揭示VEGFA的下调参与大鼠抑郁症的病理过程。

3.4 黄连阿胶汤治疗抑郁症的通路分析

由KEGG通路富集分析可知，黄连阿胶汤通过多条通路对抑郁症进行治疗，主要涉及HIF-1、TNF和cAMP信号通路。

HIF-1信号通路是维持氧平衡的重要通路，与其他通路交叉，形成细胞低氧应答的特异性和多样性。Li等[22]研究了FG-4592对抑郁的治疗作用，结果表明，FG-4592可以通过HIF-1介导的神经发生与突触可塑性改善大鼠的抑郁样行为。TNF是炎症的重要通路，其中TNF-α可以破坏血脑屏障，使得小鼠出现抑郁样行为[23-24]。Xu等[25-26]从小胶质细胞的激活与神经炎症2个方面研究了牛蒡子苷元(Arctigenin)对抑郁的治疗作用，结果表明，慢性不可预测轻度应激通过激活小胶质细胞TNF-α/TNF受体1(TNFR1)信号通路、增加核因子κB的磷酸化和核转位以及诱导炎症使得小鼠出现抑郁样行为，而Arctigenin可以有效逆转这种趋势并减少炎症引起的抑郁样行为。cAMP是研究最早、最为深入的抗抑郁信号转导通路。Fujita等[27]研究了抑郁症患者使用5-羟色胺再摄取抑制剂前后大脑中cAMP信号传导的变化，结果表明，未服药的患者表现出cAMP级联反应活性显著降低，2个月的5-羟色胺再摄取抑制剂治疗显著增加了cAMP活性。

通过以上分析，本研究推测黄连阿胶汤可能通过调节氧化应激、炎症因子和神经营养因子对抑郁症产生治疗作用，见图6。

图6 黄连阿胶汤治疗抑郁症的机制图Fig 6 Mechanism diagram of Huanglian Ejiao decoction in treating depression

综上所述，网络药理学和体外实验结果表明，黄连阿胶汤通过多成分、多靶点和多途径的协同作用来缓解抑郁症。本研究推测黄连阿胶汤可能通过HIF-1通路、TNF通路和cAMP通路，IL-1β、IL-6、TNF、Akt1和STAT3靶点调节氧平衡、炎症因子和神经营养因子，从而对抑郁症发挥治疗作用。本研究揭示了黄连阿胶汤治疗抑郁症的作用机制，为中医药的进一步应用提供了基础。

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