香樟中芝麻素类成分测定方法构建及含量分析

郭茂，黄冰冰，李林海，林思荣，黄鸣清，倪林

(1.福建省食品药品质量检验研究院，福建 福州 350012；
2.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002；
3.福建中医药大学，药学院，福建 福州 350122)

香樟(Cinnamomumcamphoravar.linalooliferaFujita)为樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)常绿乔木植物[1]，是我国亚热带常绿阔叶林的主要树种之一[2]，福建、台湾、江西、广东等地区均有分布[3]。福建林地水肥等条件适宜香樟生长，良种已全覆盖，成为香樟精油的主产区。香樟枝叶用于精油提取后，大量枝叶残渣被废弃，植物资源利用率低[2]、严重污染环境，已成为产业发展亟需解决的关键科学问题。课题组致力于香樟资源的开发与利用研究，前期从枝叶提取物中分离、纯化和鉴定化合物20余个[4]，其中两个双四氢呋喃木脂素类化合物，即芝麻素和9-羟基芝麻素含量大，具有良好的抗菌[5]、抗癌[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]、降血压[9]、降低胆固醇[10]、保肝[11]等功效，可用于农药增效剂、食品、保健产品添加剂等[12]，市场前景广阔。因此，本文构建了高效液相色谱(HPLC)法同时测定芝麻素和9-羟基芝麻素含量的方法，并对不同产地香樟原料进行测定，为香樟植物资源化学利用、开发芝麻素和9-羟基芝麻素制备工艺、产品质量标准等奠定基础。

1.1 药材、试剂与仪器 香樟样品于2021年5月在福建泉州市安溪半林国有林场(北纬24°56′55″，东经117°59′36″，海拔728 m)和福建泉州市南安向阳乡海山果林场(北纬25°17′38″，东经118°31′10″，海拔700 m)采集，经福建农林大学植物保护学院倪林博士鉴定为樟科樟属樟(C.camphora)，从其樟油化学成分看，应为香樟(C.camphoravar.linalooliferaFujita)，品系有“南安1号”和“牡丹1号”。植物枝叶标本存放于福建农林大学自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心样品室。

Diamonsil C18分析型反相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)(北京迪马科技有限公司)；
分析纯乙酸乙酯、甲醇等(北京化工厂)；
色谱级甲醇、乙腈(德国Merck公司)；
水为超纯水。芝麻素和9-羟基芝麻素的对照品为实验室自制，经ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR测定，数据与文献[4]对照一致，HPLC测定化合物纯度，归一化法计算质量分数为99%以上。

Waters W2695-QDA高效液相色谱仪(美国Waters公司)；
PR224ZH/E型电子分析天平(美国OHAUS公司)；
Millipore超纯水系统(美国Millipore公司)；
KQ50ODE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
TQ-400Y 高速多功能粉碎机(永康市天祺盛世工贸有限公司)。

1.2 溶液的配制

1.2.1 混合对照品溶液制备 分别取适量的芝麻素和9-羟基芝麻素对照品，精密称定，加入适量乙酸乙酯稀释定容至5 mL，制得对照品储存溶液。分别量取1.0 mL对照品储存溶液混合，即得芝麻素浓度为1.08 mg·mL-1、9-羟基芝麻素浓度为1.23 mg·mL-1的混合对照品溶液；
再分别准确量取0.4 mL对照品储存溶液混合，即得芝麻素浓度为0.08 mg·mL-1、9-羟基芝麻素浓度为0.08 mg·mL-1的混合对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液制备 取适量阴干香樟样品，粉碎，称取2.0 g，置250 mL圆底烧瓶中，加入50 mL乙酸乙酯，称总重，在加热套中回流提取1 h，冷却后补足差重，滤过，精密吸取4 mL置蒸发皿中，将溶剂吹干，残渣加甲醇适量使溶解，并转移至5 mL量瓶中，定容，即得。

1.3 HPLC测定含量方法的构建

1.3.1 色谱条件 采用Dikma Diamonsil C18分析型反相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱(0～30 min,30% A → 42% A;30～45 min,42% A → 65% A)，流速1.0 mL·min-1,检测波长为235 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

1.3.2 系统适用性实验 按照“1.3.1”项下色谱条件，分别取“1.2.1”项下配备的混合对照品溶液与“1.2.2”项下配备的供试品溶液进样10 μL，记录色谱图。

1.3.3 线性关系考察 在“1.3.1”项下的色谱条件下，取“1.2.1”项下芝麻素浓度为0.08 mg·mL-1、9-羟基芝麻素浓度为0.08 mg·mL-1的混合对照品溶液分别进样1、6、10、20 μL，取“1.2.2”项下芝麻素浓度为1.08 mg·mL-1、9-羟基芝麻素浓度为1.23 mg·mL-1的混合对照品溶液分别进样2、4、6、8、10 μL，测定峰面积；
以峰面积为纵坐标，分别以对照品的2个含量为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 精密度试验 在“1.3.1”项下的色谱条件下，将“1.2.2”项下制备的混合供试品溶液连续吸取进样6次，每次进样10 μL，测定，分别记录下芝麻素和9-羟基芝麻素的峰面积积分值，由此计算出两个化合物的RSD。

1.3.5 稳定性试验 在“1.3.1”项下的色谱条件下，将“1.2.2”项下制备的混合供试品溶液室温放置0、2、4、8、12、24 h，分别进样10 μL，测定，分别记录下芝麻素和9-羟基芝麻素的峰面积积分值，由此计算出两个化合物的RSD。

1.3.6 重复性试验 取同一批香樟样品6份，按“1.2.2”项下的方法分别制备6份供试品溶液，在“1.3.1”项下的色谱条件下分别测定，记录芝麻素和9-羟基芝麻素的峰面积，计算相应的RSD。

1.3.7 加样回收率试验 精密称取6份已知含量的香樟粉末，分别加入适量的混合对照品溶液，于“1.3.1”项下的色谱条件下测定，记录芝麻素和9-羟基芝麻素的峰面积，计算加样回收率。

1.3.8 含量测定 取香樟样品，按“1.2.2”项下方法操作，并在“1.3.1”项下色谱条件下通过HPLC测定，以外标法计算样品中芝麻素和9-羟基芝麻素的含量。

1.3.9 数据分析 利用Excel 2016和SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。

2.1 样品与对照品的HPLC分析 混合对照品和供试品的HPLC色谱见图1。在235 nm检测波长下，混合对照品和供试品两者的芝麻素和9-羟基芝麻素分离度均大于1.5，实现完全分离，保留时间分别为30.488和43.624 min，即“1.3.1” 项下色谱条件方法可用于香樟中芝麻素和9-羟基芝麻素的含量测定。

A.对照品；
B.样品 1.芝麻素;2.9-羟基芝麻素

2.2 考察结果 对照品的线性回归方程、线性范围结果见表1。

表1 对照品的线性回归方程、线性范围

数据结果表明，芝麻素和9-羟基芝麻素在0.1～10 μg范围内均有良好的线性关系；
精密度试验的RSD分别为0.29%和0.28%，表明该方法精密度良好，符合精密度考察要求；
稳定性试验的RSD分别为0.88%和0.67%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好；
重复性试验的RSD分别为0.55%和0.48%，表明该方法重复性良好。

2.3 加样回收率试验 加样回收率试验结果如表2所示。

表2 加样回收率试验结果

由加样回收率试验结果可以看出，两个芝麻素类成分的平均加样回收率分别为97.5%(RSD=0.77%)和98.4%(RSD=0.82%)，RSD均小于3%，表明该方法准确、可靠，可用于不同香樟植物原料中芝麻素类成分的测定。

2.4 含量测定 香樟样品含量测定结果见表3～6。

表3 不同坡位的样品中芝麻素和9-羟基芝麻素测定结果(mg·g-1,n=3)

香樟不同组织部位(枝条、叶片)中芝麻素类含量存在差异。3个不同采集地点的样品中芝麻素和9-羟基芝麻素含量均表现为香樟叶片中最高，且香樟叶片中的芝麻素类含量远高于枝条中含量，其中不同香樟组织部位的芝麻素类含量表现为：嫩叶>老叶>嫩枝>老枝，香樟嫩叶中的芝麻素和9-羟基芝麻素含量分别是老叶中含量的2倍和1.5倍。采集自不同坡位(上坡段、中坡段和下坡段)的3个香樟样品中芝麻素类含量存在差异。坡位对其含量具有显著影响，3个坡位的芝麻素类均含量表现为：上坡段>中坡段>下坡段。另外，对比“南安1号”和“牡丹1号”两个品系，枝条和叶片中芝麻素类的含量均为“南安1号”品系最高。据已有文献报道，香樟叶中芝麻素含量是芝麻的1～3倍[13-14]，是细辛的2～4倍[15]，是紫珠叶的10～22倍[16]，是两面针的23～48倍[17]，且香樟叶中含量最高的化合物9-羟基芝麻素，其含量远高于马鞭草、黄毛豆腐柴、石榴等植物[18-19]。

表4 不同品系样品中芝麻素和9-羟基芝麻素测定结果(mg·g-1,n=3)

表5 不同香樟组织部位中芝麻素和9-羟基芝麻素测定结果(mg·g-1,n=3)

表6 品系、坡位和香樟组织部位对芝麻素含量和9-羟基芝麻素含量的主体间效应检验

通过多元方差分析，3个主效应(品系、坡位与香樟组织部位)的4种检验统计量均小于显著性水平0.05，说明三因素分别对两个成分含量有显著影响;“品系＊坡位＊香樟组织部位”的4种检验统计量均小于显著性水平0.05，说明三因素交互共同对两个成分含量的影响存在协同作用。通过两个因变量(芝麻素和9-羟基芝麻素含量)在三因素上的差异分析，两个成分含量在三因素的显著性均为0.000(<0.05)，说明两个成分含量在3个因素上都存在显著差异。两个成分含量在“品系＊坡位＊香樟树组织部位”上的显著性分别为0.000(<0.05)和0.002(<0.05)，所以，三因素的交互作用在两个成分含量上均存在显著差异。

香樟中芝麻素类成分的合成和积累会受到不同品系、不同种植坡位和不同组织部位的影响。种植于不同坡位的香樟，其生长环境有所不同，不同坡位的光照、土壤条件、水分和肥力等均有差异，且香樟嫩叶和嫩枝部位的光照条件优于老叶和老枝，叶片受光面积大于枝条，明显种植在上坡位的香樟中芝麻素类成分含量最高。因此，光照、土壤、水分和肥力等环境条件对香樟中的芝麻素类成分的合成和积累会造成很大的影响。故在上坡位的环境下种植“南安1号”品系的香樟，在此条件下更有利于芝麻素类成分的合成和积累。香樟资源丰富，开发利用潜力较大，今后可着重利用“南安1号”品系香樟的叶片生产芝麻素系列产品，可替代芝麻成为新资源，弥补香樟植物资源利用不足问题，开发高附加值化学产品，有效延伸香樟产业链。

3.1 建立了HPLC测定香樟中两个芝麻素类成分含量的方法，该方法操作简单，结果准确，各项方法学考察结果符合有关规定，为香樟的资源开发利用和质量评价提供科学依据。

3.2 种植上坡位的“南安1号”品系香樟的嫩叶中芝麻素类成分含量最高，芝麻素可达(2.596±0.27)mg·g-1，9-羟基芝麻素可达(4.171±0.21)mg·g-1。

3.3 不同品系、坡位及香樟组织部位对香樟中芝麻素类成分的含量具有协同作用，且对香樟中芝麻素类成分的合成和积累具有显著影响。

3.4 香樟中芝麻素类成分的合成和积累会受到光照、土壤、水分和肥力等不同环境因素的影响。

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