猪源绿色气球菌的分离与鉴定

郭伟娜，路振香，陈雪龙，刘 畅，张留君，赵 磊

(安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳 233100)

绿色气球菌(Aerococcusviridans)属链球菌科、气球菌属，是一种呈二联或四联方式排列、无芽孢、不运动、兼性厌氧的革兰氏阳性球菌。目前，气球菌属包括8个种[1]，即绿色气球菌、尿道气球、柯氏气球菌、血气球菌、人尿气球菌、马尿气球菌、猪气球菌、阴道气球菌。绿色气球菌是一种条件致病菌，可引起人的菌血症、心内膜炎、脑膜炎和关节炎等[2]。兽医临床上该菌可引起奶牛乳腺炎、猪关节炎、猪脑膜炎和猪肺炎等[3-4]，还可感染山羊、鸡、鸭、竹鼠等动物[5-8]。猪感染绿色气球菌后主要表现为精神不振、食欲降低、体温升高、气喘、关节肿大，背部、腹部、四肢内侧等皮肤有出血现象，下痢甚至血便等；
剖检病理变化主要为心脏和肺脏表面有纤维素性渗出物，心包积液，胸腔积液，腹腔器官有纤维素性渗出物附着，腹腔、关节积液，脾脏肿大，肺脏出血水肿，淋巴结出血等[4]。

目前，国外主要是关于鱼、虾、蟹等水产动物感染绿色气球菌的报道，2010年首次从患病的罗非鱼分离到2株绿色气球菌[9]，但对猪绿色气球菌的研究较少。本研究从某猪场送检的病死猪肝脏组织中进行病原分离培养，以及16S rRNA基因的PCR扩增与测序分析，为该病的临床诊断及防控提供参考。

1.1 材料

1.1.1 病料来源 安徽省凤阳县某生猪养殖场所送检的病死猪肝脏组织。患病猪临床表现为体温升高，被毛粗乱，气喘，剖检病理变化有淋巴结肿大，气管有黏液及出血，肺脏出血，脾脏肿大，肝脏肿大有出血。

1.1.2 培养基及试剂 血琼脂培养基，常德比克曼生物科技有限公司产品；
LB肉汤培养基、PCR扩增试剂盒、琼脂糖、50×TAE缓冲液、DNA Marker DL 2 000等，生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.1.3 仪器设备 立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50FB)，上海申安医疗器械厂产品；
电子天平(BS224S)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品；
超净工作台(ZWZM-1)，上海智城分析仪器制造有限公司产品；
隔水式恒温培养箱(GSP-9050MBE)，上海森信实验仪器有限公司产品；
小型台式高速离心机(5424)，德国Eppendorf公司产品；
PCR扩增仪(ETC811)，北京东胜生物科技有限公司产品；
凝胶成像仪(Tanon1600)，上海天能科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 分离纯化和染色镜检 用灭菌接种环蘸取病死猪的肝脏组织在血琼脂培养基上划线接种，37℃培养24 h，挑取单菌落进行纯化培养。然后对纯化的病原菌进行革兰氏染色，镜检观察。

1.2.2 生化试验 用接种环或接种针将分离菌分别接种至糖发酵管(葡萄糖、乳糖、蔗糖)、蛋白胨水和葡萄糖蛋白胨水中，37℃培养24 h～48 h后，观察糖发酵试验、甲基红试验、二乙酰试验(VP试验)和吲哚形成试验结果。

1.2.3 DNA模板的制备 用灭菌接种环挑取单个菌落接种于LB肉汤培养基，37℃、180 r/min振荡培养24 h。之后采用煮沸法提取核酸，即为DNA模板。

1.2.4 16S rRNA基因的PCR扩增及测序分析 参考细菌16S rRNA基因序列的通用引物，由通用生物系统(安徽)股份有限公司合成，引物序列如下：27-F:5′- AGAGTTTGATCATGGCTC3′，1525-R:5′-AAGGAGGTGATCCAACC-3′。

PCR反应体系为50 μL：PCR Master Mix 25 μL，上、下引物各2 μL，DNA模板5 μL，无菌水16 μL。PCR反应条件：95℃ 5 min；
95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；
72℃ 10 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至通用生物系统(安徽)股份有限公司测序，测序结果在NCBI网站上核酸数据库中进行比对分析，用DNAStar软件中的Megalign程序进行同源性分析和遗传进化树的构建。

2.1 分离培养及染色镜检结果

分离菌在血琼脂培养基上分离纯化后的菌落特征见图1，其中左图为菌落正面观察结果，右图为菌落背面观察结果。分离菌培养特性主要为表面光滑、湿润、边缘整齐、轻度隆起、灰白色、圆形小菌落，菌落周围有草绿色的不完全溶血现象。分离菌的革兰氏染色镜检结果为蓝紫色的革兰氏阳性球菌，呈二联或四联方式排列，无芽孢。

图1 分离菌在血琼脂培养基上的培养特性

图2 分离菌革兰氏染色镜检结果(10×100)

2.2 生化试验结果

生化试验结果表明，糖发酵试验中，分离菌对葡萄糖、乳糖和蔗糖均能分解产酸但不产气，培养液由紫色变为黄色；
甲基红试验的结果为阳性，培养液由黄色变为红色；
吲哚试验与VP试验的结果为阴性，仍为黄色。

2.3 PCR扩增及测定分析结果

分离菌16S rRNA基因的PCR扩增产物通过琼脂凝胶电泳检测，发现有一条1500 bp左右的条带，与目的条带相符(图3)。

M.DNA标准DL 2 000；
1.分离菌的PCR产物；
2.阴性对照

将分离菌16S rRNA基因的测序结果在NCBI网站上的核酸数据库中进行序列比对分析，发现其与绿色气球菌719菌株的16S rRNA基因序列(GenBank登录号：MN513224)相似性高达99.86%。同时将分离菌16S rRNA基因测序结果(seq1)与GenBank中已有的10株绿色气球菌参考菌株(表1)，用Megalign进行同源性分析和遗传进化树的构建(图4和图5)，图中seq1表示本研究中分离菌序列，其他菌株均用GenBank登录号表示。由图4可知，分离菌与参考菌株的同源性为99.2%～99.3%，由图5可知，分离菌与绿色气球菌菌株JCM20461、219、FC25026、719、NBRC 12317、DSD-PW4-OH13、SNSK 102位于同一大分支上，遗传亲缘关系较近。结果证实分离菌为绿色气球菌，将菌株命名为AHFY，将测序结果上传至NCBI核酸数据库中，获得GenBank登录号为OM278267。

图4 16S rRNA基因序列同源性分析

图5 基于16S rRNA基因序列构建的遗传进化树

表1 绿色气球菌参考菌株信息

绿色气球菌是一种条件致病菌，在动物机体抵抗力下降者与其他病原混合感染时会引起菌血症、败血症、脑膜炎、关节炎、乳腺炎等病理变化。绿色气球菌既可以感染幼龄动物，又可以感染成年动物，具有很强的致病性，同时又可以跨种属感染，因此，兽医临床上应多关注该菌的致病性研究。本研究主要是从病死猪的肝脏组织分离到1株绿色气球菌AHFY菌株，与文献[10]分离的绿色气球菌组织来源相同。另外，其他动物中也有从肝脏分离绿色气球菌的报道[5，7]。绿色气球菌感染猪可存在于多种组织器官，如心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、关节液等。当某种病原感染后，猪发生继发感染或混合感染的现象日益严重。猪的关节炎、脑膜炎、肺炎、菌血症等病症除与绿色气球菌有关外，还与猪链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、肺炎支原体、大肠埃希氏菌等多种病原有关，如猪绿色气球菌和猪链球菌共同感染引起仔猪细菌性脑膜炎[11]，猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒等免疫抑制性病毒感染后可引起绿色气球菌的继发感染和混合感染[2]。另外，猪场环境卫生和管理因素对猪传染病的发生起到关键作用，由于绿色气球菌是一种条件致病菌，有些生猪养殖场不注重饲养环境，消毒不彻底，为一些条件致病菌的存活和致病创造了有利条件。因此，在高度重视猪病毒性疾病的同时，需更加关注条件致病菌的感染。

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