新疆野生中国美味蘑菇的遗传多样性分析

罗 影，贾培松，努尔孜亚·亚力买买提，祁颢萱，赵振豪，贾文捷

(1.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091；
2.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830091；
3.新疆农业大学科学技术学院，乌鲁木齐 830091)

【研究意义】中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)隶属于真菌门、担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales)，蘑菇科(Agaricaceae)，蘑菇属(Agaricus)[1]。王卓仁等[2]从形态学和系统发育学，命名为中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。其属于中亚地区特有种，主要生长在内陆湖泊沿岸，芦苇腐殖质丰富的沙滩上，子实体硕大。分析中国美味蘑菇野生资源开展种质资源评价和遗传多样性，对于中国美味蘑菇新品种选育、种质资源保护与开发利用等具有重要意义。【前人研究进展】ISSR可以直接从DNA水平上检测DNA多态性，扩增条带清晰、多态性强、重复性好，是目前在分析和评估生物种群的遗传多样性中使用最广泛的分子标记之一[3]，木耳[4-6]、草菇[7]、灰树花[8]、白灵菇[9]、香菇[10-12]等均有多校性评价文献。【本研究切入点】对中国美味蘑菇的研究，主要从其形态描述、生境调查[13,14]、营养成分分析[15-18]及驯化栽培[19-22]进行了研究。目前尚未有应用ISSR分子标记对中国美味蘑菇进行遗传多样性分析的报道。亟需分析新疆野生中国美味蘑菇的遗传多样性。【拟解决的关键问题】采用生物学培养特征与ISSR分子标记相结合的方法，对从新疆博斯腾湖周边采集的20个野生中国美味蘑菇菌株进行遗传多样性分析，为保护开发中国美味蘑菇种质资源及新品种选育等提供科学依据。

1.1 材 料

20个野生中国美味蘑菇子实体均采集于新疆博湖县，菌株保藏于新疆农业农业科学院植物保护研究所。

1.2 方 法

1.2.1 菌丝活化与菌丝体收集

将菌种接种到PDA平板上，25℃下避光培养20 d左右活化。活化后，取菌丝尖端再接于PDA平板，培养基表面铺一层玻璃纸。固体培养的菌丝体，用灭菌的接种刮沿着玻璃纸的表面将菌丝体轻轻刮下，置称量纸上，天平称量备用。

1.2.2 菌株生物学培养特征测定

将活化的20个中国美味蘑菇供试菌株，打孔器分别打取活化后适龄菌种菌落边缘作接种块，接种至PDA培养基中央，每个菌株5个重复，25℃避光培养。定期观察菌株生长情况，观察指标有：菌丝颜色、菌落边缘形态、菌丝浓密度等4项菌丝培养特征指标，菌丝生长速度采用“十”字交叉法测量计算菌落直径。

1.2.3 DNA提取

对采集的菌丝体进行干燥处理，取一部分干燥子实体，采用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度。

1.2.4 ITS序列测定

采用通用引物 ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和 ITS4：TCCTCCGCTTATTGGATATGC，(由生工生物工程股份有限公司合成)进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL：引物(10 μmol/L各1.0 μL、模板1.0 μL，2×TaqPCR MasterMix12.5 μL无菌双蒸水补足至25 μL。PCR扩增程序：94℃预变性4 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃修复延伸10 min。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

将PCR产物交于生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果提交至NCBI核酸数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，进行BLAST比对分析。选取同源性较高的序列进行系统进化分析，利用MEGA 6.0软件首先进行多重序列比对，再采用Neighbour-joining法构建系统发育树，进行1 000次Bootstrap自举法检验。

将测序结果在NCBI上进行BLAST，选取同源性较高的序列及现有文献报道的序列，以口蘑科口蘑属松茸 (TricholomamatsutakeEU294302.1) 的ITS为外群，与采集的20个野生中国美味蘑菇样本一起，用MEGA 6.0中Neighbor-joining 法(Maximum likehood Bootstrap trials=1 000)，构建系统发育树。

1.2.5 ISSR-PCR扩增与聚类分析

通过引物筛选实验[23,24]从42个引物[25,26]中筛选出15个引物，扩增结果多态性较高，且扩增出丰富的多态性位点。筛选出引物进行ISSR-PCR扩增，所用引物及扩增程序参考李辉平[3]和朱坚[26]方法，由上海生工生物有限公司合成。

扩增反应体系25 μL，其中2×TaqPCR MasterMix12.5 μL，引物(0.2 mmol/L)1 μL，模板1 μL，用ddH2O补齐至25 μL。扩增体系：94℃预变性5 min；
94℃变性1 min，退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；
72℃补平10 min。将扩增产物5 μL，点样于1.5%琼脂糖凝胶上电泳，检测ISSR扩增结果。表1

1.3 数据处理

将ISSR-PCR 的电泳结果人工比对校正，有条带记为1，无条带记为0，构建初始“0/1”矩阵表。统计条带总数及多态性条带数并计算多态位点百分率P，公式为：P=k/n(100%)，式中：P为多态位点百分率，k为多态性位点数，n为测定的位点总数。

使用NTSYSpc分析软件对所获数据进行聚类分析，生成遗传聚类图，分析聚供试野生中国美味蘑菇菌株间的遗传多样性及遗传分化特征。

表1 供试ISSR引物的序列

图1 不同中国美味蘑菇菌株的菌丝形态

2.1 野生中国美味蘑菇菌株菌丝培养特征比较

研究表明，各菌株菌丝生长速度、菌丝长势及是否形成原基上均有明显差异，其中菌株BK039、BK042菌丝生长最快，平均生长速度分别为1.46、1.44 mm/d；
菌株BK052菌丝生长最慢，平均生长速度为0.22 mm/d。易形成原基的菌株有BK36、BK40、BK52、BK72。表2

根据菌丝形态、菌丝浓密度及是否形成原基等，将20个中国美味蘑菇菌株划分为4个组群。第1组群：气生菌丝浓密，菌落边缘菌丝浓白，不易形成原基，包括BK01、BK03、BK08、BK10、BK30、BK50、BK51、BK73、BK74、BK75；
第2组群：气生菌丝一般，不易形成原基，包括BK38、BK39、BK42、BK49；
第3组群：气生菌丝一般，易形成原基，包括BK36、BK40、BK52、BK72；
第4组群：菌丝稀疏，且不易形成原基，包括BK11、BK33。图1

表2 中国美味蘑菇菌株的菌丝培养特征描述

2.2 野生中国美味蘑菇ITS分子鉴定

研究表明，中国美味蘑菇的ITS序列大小介于720～750 bp，采集的20株野生样本Blast结果均为中国美味蘑菇，构建发育树也聚为一簇，从分子水平上鉴定采集的样本均为中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。图2

图2 基于ITS序列的中国美味蘑菇的系统发育树

2.3 野生中国美味蘑菇菌株的ISSR多态性分析

研究表明，实验共选择42个ISSR引物，其中有16个引物对供试的20个中国美味蘑菇菌株有很好的扩增效果，条带清晰，重复性好。16个引物共扩增出206条较为清晰的DNA条带，平均每个引物扩增出12.88条多态性条带。平均多态性条带频率为83.46%，其中P1、P5、P22等3个引物多态性比率为100%，引物 P25多态性比率为 92.31%。供试菌株间的遗传多态性较高。表3

表3 ISSR 引物的扩增结果及多态性

2.4 供试菌株的聚类

研究表明，20个供试中国美味蘑菇菌株间遗传相似系数范围在 0.60～0.91，在遗传相似系数0.60水平上15个供试菌株分为2个类群，BK033和BK036与其他菌株区分开来，说明BK033和BK036与其他供试中国美味蘑菇之间的遗传差异较大。当遗传相似系数为0.80时，可分为8个类群，最大的类群包括12个菌株，占总数的60%，另有2个菌株成一个类群，其他菌株单独成一个类群，博湖县的中国美味蘑菇已经发生较为明显的遗传分化现象。当遗传相似系数为0.91时，可分为17个类群，其中BK03和BK08、BK40和BK49、BK050和BK052两两为一类，这三组菌株之间亲缘性较近；
其他菌株各自为一类群，20个供试中国美味蘑菇菌株均采自博斯腾湖附近，具有丰富的遗传多样性。图3

图3 供试中国美味蘑菇菌株ISSR多态性的聚类

3.1中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)是2015年王卓仁等[2]从形态学和系统发育学进行研究命名的新种。在此之前主要对其生境[13,14]、子实体营养成分[15-18]、驯化栽培[19-22]及其生境微生物群落[27]进行了分析研究。

3.2ISSR标记是由Zietkiewi CZ等[28]创建的一种简单重复序列间扩增多态性分子标记，直接从DNA水平上检测基因多态性。

3.3在ISSR分析中，在遗传相似系数为0.75时，将20个供试中国美味蘑菇菌株划分为4个种群，但是与表观形态学的分组不一致。在遗传相似系数为0.80时，可划分为8个类群，最大的类群包括12个菌株，占总数的60%，与表观形态学分组略有差异，其又进一步将表观形态学分组的第1组群进一步细化分组，20个供试中国美味蘑菇菌株虽然均采自博斯腾湖附近，但是各菌株间也具有丰富的遗传多样性。ISSR分子标记在木耳[4-6]、草菇[7]、灰树花[8]、白灵菇[9]、香菇[10-12]等均有应用，ISSR标记在食用菌种植资源遗传多样性、亲缘关系分析中应用是可信的。

采集于新疆博湖县的20个样本均为中国美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。将20个样本划分为4个组群；
16条ISSR引物共扩增出206条清晰的DNA条带，多态性条带176条，多态比率为83.50%。各菌株间遗传相似系数范围在 0.60～0.91，遗传相似系数为0.80时，20个样本分为8个类群。新疆博湖县的中国美味蘑菇已开始发生遗传分化，具有丰富的遗传多样性，有较好的驯化育种潜力。

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